《眼科新进展》  2018年7期 634-637   出版日期：2018-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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热休克蛋白65对视网膜毛细血管粥样硬化的影响


    当前研究发现，视网膜毛细血管粥样硬化为炎症性疾病，受免疫调节，在视网膜毛细血管粥样硬化发生及发展过程中热休克蛋白65（heat shock protein 65，HSP65）起到关键作用^［1-3］。HSP65在进化过程中序列高度保守，是细胞应激反应的生物标志及细胞的内源性保护蛋白，对维持机体的自身稳定性起重要作用^［4-6］。现研究已表明，HSP65是一类免疫原性蛋白，通过抗原递呈细胞提呈激活免疫系统，参与机体的抗感染免疫反应、自身免疫反应、肿瘤免疫反应等^［7-9］。经过病理学研究得出，冠状动脉粥样硬化斑块中HSP65为高表达，主要出现在斑块的泡沫细胞、内皮细胞等细胞中^［10-12］。本研究采用免疫印迹（Western-blot）法检测HSP65在视网膜动脉粥样硬化中的表达，以进一步探讨HSP65在视网膜毛细血管粥样硬化中的作用。
1　材料与方法
1.1　实验动物　本研究符合动物伦理学标准且得到我院伦理委员会的批准。选择成年Wistar大鼠30只，鼠龄为6~8周，均为雄性，体质量为180~200 g，由我院的实验动物中心提供。12 h/12 h明暗交替照明，分笼饲养，自由饮食与饮水，保持安静，室温24 ℃。
1.2　视网膜毛细血管粥样硬化模型的建立　大鼠适应性喂食1周普通颗粒饲料。之后随机将大鼠分为对照组与实验组，每组各15只，分别喂食普通颗粒饲料与高脂饲料（普通颗粒饲料与高脂饲料均由我院实验动物中心提供，其中，高脂饲料包括质量分数84%普通颗粒饲料、质量分数10%蛋黄粉、质量分数5%猪油以及质量分数1%胆固醇），共喂养8周。
1.3　血清学指标测定　8周实验结束时，全部大鼠均空腹12 h，腹腔注射100 g·L^-1水合氯醛全身麻醉，心脏采血，3000 r·min^-1离心10 min，半径为10 cm，将上层血清分离。以全自动生化分析仪（HP200型；日本日立公司）对血糖、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）等指标进行检测，血浆致动脉粥样硬化指数采用log［TG/HDL-C］方法计算。同时使用酶联免疫吸附法测定血清中HSP65的含量，检测试剂盒来自上海生工生物工程有限公司。
1.4　病理学检测　采血结束后断颈处死所有大鼠，取双眼眼球放置于40 g·L^-1多聚甲醛溶液中固定24 h以上，沿锯齿缘环形剪开眼球，去除眼前节，水中分离视网膜，并行HE染色，电子显微镜下观察，同时在低倍镜视野下对大鼠视网膜毛细血管的内弹力层、斑块等进行勾勒，测量与计算斑块面积、血管面积、斑块比例（斑块面积/血管面积）等指标。
1.5　Western-blot检测　采用Western-blot检测HSP65蛋白的表达。分离视网膜时，每组随机选取3只大鼠的视网膜用于总蛋白的提取，将HSP65一抗与靶蛋白结合后进行凝胶图像定量分析，测定蛋白相对含量，采用β-actin为上样对照。
1.6　统计学处理　使用SPSS 20.0软件分析数据，计量资料使用均数±标准差描述，组间对比采用t检验，组内对比采用SNK法，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　血脂与血糖水平对比　实验组的血脂（TC、LDL-C、TG）、血糖均高于对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05；见表1），表明视网膜毛细血管粥样硬化大鼠模型造模成功。



2.2　血清中HSP65含量　实验组与对照组的血清中HSP65含量分别为（45.66±8.24）μmol·L^-1和（20.67±9.44）μmol·L^-1，实验组高于对照组，差异有统计学意义（t=8.287，P<0.05）。
2.3　病理学表现　对照组视网膜毛细血管内皮细胞层与弹力板均保持完整且贴附紧密，中层的平滑肌细胞排列整齐，无增厚，细胞质表现为嗜酸性红染（图1A、B）。实验组视网膜毛细血管内膜有程度不等的增厚，管腔呈偏心性狭窄，内膜中细胞外基质数量增多，内膜下层能够看到大量梭圆形增生细胞及充满脂质空泡的泡沫细胞，存在散在炎性细胞浸润，中层的平滑肌细胞减少（图1C、D）。实验组的血管面积、斑块面积与斑块比例均高于对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05；见表2）。




2.4　视网膜中HSP65蛋白表达　Western-blot检测结果显示，实验组大鼠视网膜中HSP65蛋白相对表达量为0.56±0.11，高于对照组的0.10±0.02，两组相比差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。



3　讨论
    HSP在进化上高度保守，不同种属间HSP氨基酸序列具有高度同源性。HSP是生物体对外界刺激发生反应而产生的应激蛋白，可触发自身免疫反应^［13-14］。在正常生理条件下，HSP呈现基础性表达；在应激情况下，HSP表达量上升15%~20%，以起到保护细胞的作用^［15-16］。HSP能促进新生多肽链的折叠、伸展、装配、跨膜运输，也能结合和稳定其他蛋白质的不稳定构象，提高细胞的抵抗力，维持细胞生存和功能^［17］。
    按照相对分子质量可以把HSP划分成HSP70、HSP65、HSP90等。HSP65是HSP家族中的重要应激蛋白之一，可参与蛋白质的运输和解聚，是许多调节蛋白和结构蛋白活化的分子伴侣^［18］。HSP65可作为免疫源性蛋白调节免疫细胞的功能。有研究发现，人源、鼠源的HSP65多肽的氨基酸序列分别存在8个可被微生物HSP65/65识别的共同位点，在动脉内皮表面过表达HSP65，可导致机体对HSP65的耐受被打破，诱导补体激活/抗体依赖性细胞毒性反应，造成免疫机制破坏^［19-20］。本研究结果显示，实验组血清中的TG、TC、LDL-C均高于对照组，血糖值也高于对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05），表明采用高脂高糖饲养制作视网膜动脉粥样硬化大鼠模型成功。本研究结果显示，实验组血清HSP65含量高于对照组，视网膜组织的HSP65蛋白相对表达量也高于对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Grundtman等^［21］研究发现，在激素抵抗型视网膜毛细血管粥样硬化患者体内，外周血单核细胞中HSP90与HSP70有表达，且随着炎症不断加重，其表达逐渐增强，同时HSP90基因的表达水平也越来越高，说明HSP的高表达不利于视网膜毛细血管粥样硬化患者的预后恢复。
    在结构上，微生物HSP65和鼠HSP65的同源性非常高，鼠HSP65能够提升机体对致病微生物的免疫力。同时，HSP65也是细胞间信号分子，能够介导及影响诸多炎症反应，通过对促炎因子的表达加以诱导，对血管壁的非特异性炎症反应起到促进作用，促使动脉粥样硬化形成。本研究病理学结果显示，对照组视网膜毛细血管内皮细胞层和弹力板均保持完整且贴附紧密；实验组视网膜毛细血管内膜有程度不等的增厚，管腔呈偏心性狭窄，内膜中细胞外基质增多。从机制上分析，在动脉粥样病变形成过程中，病原体如疱疹病毒、肺炎衣原体等，通过诱导大量合成HSP65^［22］，病原体与HSP65共同促使抗HSP65抗体产生交叉反应，最终导致视网膜毛细血管粥样硬化^［23］。
    视网膜毛细血管粥样硬化的形成以及产生致命性血栓，常与动脉粥瘤稳定性密切相关，在临床上，动脉的血栓事件也是导致发生急性动脉粥样硬化缺血性事件的主要原因之一^［24］。本研究结果显示，实验组的血管面积、斑块面积与斑块比例均高于对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。其原因可能与可溶性HSP65表达升高有关。在对人类颈动脉内膜切除术后标本的研究中发现，HSP65可能是涉及斑块稳定性进展的主要抗原，特异性识别HSP65的T淋巴细胞免疫反应比外周血中的淋巴细胞作用明显要强^［25］。也有研究发现，HSP65可能是在斑块局部巨噬细胞作用下而生成基质金属蛋白酶-2，对斑块稳定性产生影响^［26-27］。不过本研究缺乏临床随机对照试验来评价HSP65在视网膜毛细血管粥样硬化方面的诊治地位，亟待进一步深入研究。
    总之，HSP65在视网膜毛细血管粥样硬化大鼠的血清与视网膜中呈现高表达，可导致视网膜毛细血管的血管面积、斑块面积与斑块比例增加。