《眼科新进展》  2018年7期 630-633   出版日期：2018-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
四君子汤含药血清抑制晶状体上皮细胞凋亡的实验研究


    老年性白内障又称年龄相关性白内障，是一种与年龄增长密切相关的白内障类型，也是全球主要的致盲性眼病之一［1-2］，但目前尚未找到满意的药物防治方法。老年性白内障属中医“圆翳内障”的范畴，此病多因年老体衰，肝肾两亏，精血不足，或脾虚气弱，运化失健，精微输布乏力，精气不能上荣于目，不能濡养晶珠而混浊。古代医家多采用滋补肝肾的杞菊地黄丸或健脾益气的四君子汤治疗圆翳内障，本研究拟通过体外细胞培养探讨四君子汤含药血清对人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells，HLEC）凋亡的抑制作用，为四君子汤防治初、中期老年性白内障的临床推广应用提供依据，同时为临床寻求防治老年性白内障的有效药物提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　健康SPF 级SD 大鼠30只，8 周龄，体质量（200±20）g，均为雄性，购自上海斯莱克实验动物有限公司［SCXK（沪）2012-0002］。
1.1.2　实验细胞　HLEC为中山大学眼科研究中心提供的永生化HLEC-B3复苏、传代培养所得。
1.1.3　实验药材　中药颗粒剂四君子汤由福建省第二人民医院中药房提供。方药组成：人参9 g，白术9 g，茯苓9 g，甘草6 g。
1.1.4　实验试剂与仪器　DMEM培养液（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），二氧化碳培养箱（美国FORMA 3112A），透射电子显微镜（日本日立Hu-12A），倒置相差显微镜（日本Olympus），高压蒸气灭菌器（日本三洋公司），低温离心机（德国Sigma公司），细胞培养皿及细胞培养瓶（美国Corning公司）。
1.2　方法
1.2.1　中药颗粒剂的灌胃药量　按全国统编第五版《方剂学》药物用量作为人的临床剂量，根据“动物与人体的每千克体质量剂量折算系数表”［3］，成人与大鼠的折算系数为6.25，换算成 SD大鼠的剂量，四君子汤灌胃剂量最高为3.450 g·kg-1·d-1，本实验采用最高剂量减半的安全剂量灌胃，即1.725 g·kg-1·d-1，用以制备含药血清。
1.2.2　含药血清的制备　30只SD大鼠称体质量，随机分为2组，每组15只，分别为四君子汤组和空白对照组。标准饲料与饮水，适应性饲养3 d，第4天起四君子汤组按1.725 g·kg-1·d-1给予含药混悬液灌胃，每天分2次给药，时间为上午9点和下午3点，以维持一定的血药浓度，灌胃前后2 h禁止饮食，其余时间正常喂养。共用药7 d，最后一次灌胃后1 h，用100 g·L-1水氯合醛腹腔麻醉大鼠，以注射器经腹主动脉采血，立即注入干燥离心管内，垂直静置20～30 min至其自然凝血，然后3000 r·min-1离心15 min，取血清（即为四君子汤含药血清）用冻存管分装，-80 ℃冰箱保存备用。空白对照组按上述步骤予等体积生理盐水灌胃，所提取血清为空白血清。
1.2.3　细胞培养与分组　HLEC经复苏后置37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中孵育，待细胞生长融合后予以传代，并用于实验。实验分4组，阴性对照组：HLEC+DMEM培养液；过氧化氢组：空白对照组加入过氧化氢（终浓度300 μmol·L-1）作用4 h后加入DMEM培养液；空白血清组：HLEC加入过氧化氢（终浓度300 μmol·L-1）作用4 h后加入体积分数20%空白血清作用12 h；四君子汤含药血清组：HLEC加入过氧化氢（终浓度300 μmol·L-1）作用4 h后加入体积分数20%四君子汤含药血清作用12 h。各组使用的药物浓度以及药物作用时间均为预实验MTT法筛选得出。
1.2.4　流式细胞仪检测HLEC细胞周期　按作用时间取出细胞，调整细胞浓度为（1~2）×106个·mL-1，用0.01 mol·L-1 PBS（pH 7.2）清洗，1500 r·min-1离心5 min，共两次；将预冷的体积分数70%乙醇沿离心管壁缘滴入，轻轻吹打细胞，4 ℃固定12 h以上；1500 r·min-1离心5 min，去固定液，PBS清洗两次，弃上清；加入1 g·L-1 RNase A 30 μL，37 ℃恒温水浴锅中孵育30 min；加入PI染色液800 μL，4 ℃避光30 min；流式细胞术测定HLEC细胞周期，每次计数10 000个细胞，所有资料经Modfit LT2.0软件分析。
1.2.5　透射电子显微镜观察HLEC超微结构改变　将离心后的细胞以体积分数3%戊二醛-15 g·L-1多聚甲醛混合液固定，4 ℃过夜，体积分数1%锇酸后固定，醋酸铀快速染色，乙醇-丙酮脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色。于透射电子显微镜75 kV条件下观察HLEC超微结构变化。
1.3　统计学方法　采用 SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料若符合正态分布，用均数±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验或单因素方差分析并进行LSD两两比较，组内比较采用配对t检验；计量资料若不符合正态分布，组间比较用秩和检验，组内比较采用配对秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2　结果
2.1　四君子汤含药血清对HLEC细胞周期的影响　流式细胞仪测得的四君子汤含药血清对过氧化氢损伤的HLEC细胞周期的影响结果见表1，各组G1期、S期、G2期细胞的百分比方差分析均显示差异有统计学意义（均为P＜0.05）。LSD两两比较结果显示，过氧化氢组G1 期细胞比例较阴性对照组明显增加，S 期细胞比例、 G2期细胞比例均较阴性对照组减少，差异均具有统计学意义（均为P＜0.05）。空白血清组各期细胞比例与过氧化氢组相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。四君子汤含药血清组G1期细胞比例较过氧化氢组明显减少，S 期细胞比例、G2 期细胞比例均较过氧化氢组明显增加，差异均具有统计学意义（均为P＜0.05）；且四君子汤含药血清组的G1期细胞比例、S期细胞比例与阴性对照组相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。
2.2　四君子汤含药血清对HLEC超微结构的影响　阴性对照组HLEC形态规则，呈圆形或椭圆形；细胞膜完整，表面可见较多的微绒毛突起；细胞核形态多样，核膜双层、结构清晰，核内常染色质呈颗粒状均匀分布，内层核膜下有异染色质附着；核仁大而明显，或有双核仁；细胞质内线粒体丰富，可见嵴结构；细胞质内内质网、核糖体丰富，溶酶体多少不等（图1A）。过氧化氢组细胞表面微绒毛消失，染色质凝集成块分布于核膜下，核膜欠完整；细胞质内可见溶酶体（图1B）。空白血清组染色质凝集成块分布于核膜下，核仁可见，细胞质内空泡增多，线粒体、内质网等细胞器结构仍可见（图1C）。四君子汤含药血清组细胞膜完整，核内染色质凝聚成块，边集；细胞质内可见少许空泡；线粒体、内质网等细胞器结构清晰，细胞形态较规则，细胞膜表面有较多的微绒毛（图1D）。




3　讨论
    近年来研究表明，老年性白内障与晶状体氧化损伤及HLEC凋亡密切相关［4-7］。过氧化氢是活性氧族的代表性成员之一，在许多实验中被作为诱导剂来建立氧化损伤模型，这是因为外源性过氧化氢能够自由通过生物膜，能诱导多种细胞发生凋亡［7-9］。既往有学者认为细胞凋亡常伴随细胞周期的改变，但二者改变程度多不一致［10］。本研究结果也发现过氧化氢作用HLEC后G1期细胞比例明显增多，S期和G2期的细胞比例明显减少，表明过氧化氢抑制了细胞增殖周期的正常运行，阻止细胞从G1期向S期过渡，大量细胞停滞在G1期，即DNA合成前期。同时本研究从形态学上也证实了过氧化氢使HLEC出现了染色质凝集等典型的细胞凋亡形态学改变。
    以含药血清进行体外的药效学实验早在上世纪五十年代就有学者进行了探索性研究，直到1987年Iwama等［11］才正式提出“血清药理学”这个新概念。中药血清药理学在体外进行药效学研究的同时，还可以分析测定血清中药物成分的含量，可避免盲目地筛选药物有效成分的繁重工作，使中药药效和中药成分的研究更能协调一致，尤其是中药复方的研究。本实验预先通过四君子汤进行大鼠灌胃以制备含药血清，不仅能排除中药直接体外用药的干扰误差，而且能更趋于药物在体内的真实过程，在体现药物本身以及自身代谢产物所产生的药理作用的同时，又可以体现药物诱导机体产生内生性成分从而间接发挥药理作用，机体与中药的相互作用可通过含药血清展现出来，尽可能使体内与体外实验趋同［12］。
    四君子汤源自宋代《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓、甘草四味中药组成，具有益气补中，健脾养胃的作用，可用于治疗脾气虚弱型圆翳内障。四君子汤益气健脾，脾司运化，水谷精微输布正常，精气得以上荣于目而濡养晶珠，晶珠不出现混浊。近年来国内研究者发现了四君子汤具有抑制细胞凋亡、抗氧化损伤的作用［13-15］。本研究结果发现四君子汤含药血清组G1期细胞比例较过氧化氢组明显减少，S 期和 G2 期细胞比例均明显增加。透射电子显微镜下观察到四君子汤含药血清组HLEC细胞膜完整，仅细胞质内可见少许空泡，线粒体、内质网等细胞器结构清晰，细胞形态较规则，细胞膜表面有较多的微绒毛。本研究结果表明，四君子汤含药血清作用于过氧化氢诱导凋亡的HLEC后能对其产生保护作用，延缓或减轻了HLEC发生凋亡的程度，说明四君子汤具有抑制HLEC凋亡的作用。
    综上所述，四子汤含药血清能有效抑制过氧化氢诱导的HLEC凋亡，这可能是四君子汤防治老年性白内障的机制之一。