《眼科新进展》  2018年7期 625-629   出版日期：2018-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
大蒜素对青光眼滤过术后兔眼滤过泡瘢痕化的抑制作用


    青光眼是世界第一位不可逆性致盲眼病，严重危害患者的健康生活及生存质量，也给社会带来沉重的包袱，所以积极治疗尤为重要。小梁切除术是目前治疗青光眼的首选术式，该手术的主要问题是滤过泡瘢痕形成。临床研究发现导致滤过泡瘢痕形成的主要原因是球结膜下成纤维细胞过度增殖，导致外引流通道受堵，阻断滤过作用［1］。因此抑制瘢痕的形成是青光眼滤过术成功的关键，也是远期持久控制眼压的关键。青光眼术后抗瘢痕形成的药物最常见的是丝裂霉素，主要通过抑制纤维细胞增生、抗瘢痕化以促进滤过泡形成［2］，但是抗代谢药物有很多毒副作用且丝裂霉素已脱产，因此急需寻找疗效更高、毒副作用更小的药物应用于青光眼滤过手术中。近年来研究发现大蒜素可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡［3］，尤其在胃癌［4］、肝癌［5］等抗肿瘤研究中取得了较大的进展。大蒜素抑制细胞增殖的机制和丝裂霉素相似，因此本研究旨在探讨大蒜素能否替代丝裂霉素在兔眼小梁切除术后起到抑制纤维细胞增殖的作用。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物及分组　取健康同品系大白兔36只72眼，体质量1.50～2.00 kg，兔龄2～3个月，雄性，由锦州医科大学实验动物中心提供。实验前排除患有眼前节及眼底疾病，或3 d内眼压波动大于5 mmHg（1 kPa=7.5 mmHg）的大白兔，置于环境适宜，温度、湿度均相同的不锈钢笼中饲养，食水自由。将72眼随机分成大蒜素组、丝裂霉素组、生理盐水组，同一只兔双眼不能分于同一组，每组24眼。实验动物的饲养、使用、处死均按照《国家实验动物管理保护条例》执行。
1.1.2　试剂及仪器　大蒜素（大连美仑生物技术有限公司），丝裂霉素（浙江海正辉瑞制药有限公司），Masson三色染色剂盒、HE染色试剂（北京索莱宝科技有限公司）；手术显微镜（德国徕卡F20 M620），Schiotz眼压计（苏州医疗器械厂），游标卡尺（哈尔滨Links公司），光学显微镜（日本Olympus公司）。
1.2　方法
1.2.1　兔青光眼手术模型的制备　取健康兔36只（72眼），术前左氧氟沙星滴眼液1～2滴滴双眼，每天4次。排除眼前节及眼底疾病。所有小梁切除术均由同一位医师操作。常规消毒，开睑，冲洗结膜囊。表面麻醉，剪开结膜，做以穹隆为基底的结膜瓣。用镊子夹住巩膜瓣边缘，利用新月形刀平贴于巩膜的方向划开巩膜层间纤维，向前剖切至透明角膜缘内1 mm。各组分别将浸有大蒜素（1.112 kg·L-1）、丝裂霉素（0.3 g·L-1）、生理盐水的棉片放置于结膜囊-巩膜瓣-巩膜床层间，5 min后完全取出棉片，充分冲洗，前房穿刺。用镊子夹住巩膜瓣边缘，轻轻向下方牵拉，平行于角巩膜缘切除2 mm×2 mm角巩膜深层组织，周边部虹膜切除，将虹膜恢复器置于巩膜瓣上恢复虹膜。缝合巩膜瓣、结膜瓣。术后3 d典必殊眼膏每天2次涂眼。
1.2.2　术前及术后眼压测量　术前及术后1 d、4 d、7 d、14 d、28 d在表面麻醉下用Schiotz眼压计分别测量各组兔的眼压，同一眼重复测量3次，取平均值。
1.2.3　眼前节形态观察及滤过泡的面积测量　术前及术后每天观察各组结膜、角膜、滤过泡及表面血管情况。术后1 d、4 d、7 d、14 d、28 d用游标卡尺分别测量滤过泡的长和宽，计算其面积并做眼前节照相。
1.2.4　组织病理切片　术后28 d耳缘静脉空气栓塞处死所有兔，各组均取滤过泡周边组织约5 mm×5 mm，包括结膜、结膜下、巩膜全层组织，置于40 g·L-1多聚甲醛固定48 h，然后置于体积分数70％和80％乙醇中脱水各12 h，按常规操作进行逐级乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋并每隔5 mm连续性组织切片，每个标本取30张。采用苏木精-伊红染色在光学显微镜下观察滤过区的组织结构、血管及纤维组织增生情况；采用Masson三色染色法评估滤过区组织中炎症反应、胶原蛋白沉积和纤维化程度。每张切片在100倍镜下选取相同视野照相，其滤过区在200倍镜下照相。采用Image-Pro plus6.0（美国Media Cybernetics公司）图像分析软件计算滤过道内蓝绿色胶原纤维的面积占整个切片中结膜和巩膜空间总面积的百分比。
1.3　统计学方法　采用SPSS 24.0统计学软件对数据进行统计分析。统计学方法采用重复测量方差分析、单因素方差分析，数据以x?±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　各组术后眼压的改变　术后第1天3组眼压较术前降低，随后眼压逐渐回升。各组不同时间内的眼压差异均有统计学意义（均为P<0.05）。术前及术后1 d、4 d、7 d、14 d两两比较中除术后4 d丝裂霉素组眼压比生理盐水组低（P=0.025）外，其余各时间眼压两两比较，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。术后28 d生理盐水组眼压高于大蒜素组和丝裂霉素组（均为P<0.05），大蒜素组和丝裂霉素组差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2　各组兔眼前节及滤过泡形态的变化　术后各组均未出现角膜缺损、前房渗出、滤过泡渗漏等并发症。术后1～4 d，3组术区均形成功能性滤过泡，形态无明显差别；结膜可见轻度充血，滤过泡隆起、弥散。术后4～5 d充血消失。术后第7天较术后第4天，大蒜素组、丝裂霉素组和生理盐水组滤过泡面积减小量分别为（7.85±3.28）mm2、（10.73±4.44）mm2和（13.30±4.01）mm2，3组滤过泡隆起、弥散，充血明显减轻。随着时间的延长，滤过泡逐渐变小、扁平。术后第14天较术后第7天，大蒜素组、丝裂霉素组和生理盐水组兔眼滤过泡面积减小量依次为（17.85±3.75）mm2、（13.80±2.57）mm2和（22.09±4.51）mm2，生理盐水组滤过泡的面积明显小于大蒜素组和丝裂霉素组。术后第28天较术后第14天，大蒜素组、丝裂霉素组和生理盐水组兔眼滤过泡面积减小量依次为（5.45±0.88）mm2、（5.87±1.67）mm2和（4.06±0.84）mm2，术后第28天，大蒜素组和丝裂霉素组可见小而扁平的滤过泡，形态及大小无明显差别，生理盐水组滤过泡已消失。见图1。
    


术后1~4 d 3组滤过泡面积分别达到最大值，之后滤过泡面积逐渐减小。统计学分析结果示，3组滤过泡面积减小量在不同的时间点上是不同的（P<0.05）。不同分组之间的滤过泡面积减小量有明显差异（P<0.05）。术后大蒜素组与丝裂霉素组滤过泡面积减小幅度相同，差异无统计学意义（P>0.05），生理盐水组比大蒜素组和丝裂霉素组的滤过泡面积减小速度更快，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。





2.3　病理学检查结果　术后28 d各组结膜上皮均完整无破损及增厚。HE染色显示大蒜素组和丝裂霉素组兔眼瘢痕组织较少，滤过通道较宽。生理盐水组兔眼瘢痕组织较多，滤过通道狭窄（图2）。Masson染色显示大蒜素组和丝裂霉素组可见少量炎性细胞浸润，滤过区成纤维细胞及胶原纤维疏松，结膜及巩膜间隙较宽。生理盐水组可见大量炎性细胞浸润，滤过区成纤维细胞及胶原纤维致密，结膜及巩膜间隙较窄，形成大量的瘢痕组织（图3）。术后28 d根据胶原纤维占整个结膜和巩膜空间总面积的百分比分析，大蒜素组［（58.13±5.33）%］比丝裂霉素组［（62.42±2.95）%］胶原纤维少，差异有统计学意义（P<0.05），大蒜素组和丝裂霉素组均比生理盐水组［（89.75±3.91）%］胶原纤维少，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。
3　讨论
    青光眼是最常见的致盲眼病之一。患者眼压升高引起一系列视功能损害，比如视野缺损、视盘凹陷，最终全盲。目前手术是中晚期青光眼最有效的治疗方法，该手术面临的主要问题是青光眼术后滤过泡瘢痕化。目前青光眼术后抗瘢痕形成的药物大致可分为以下几类：糖皮质激素、抗代谢药物、胶原交联抑制剂、抗凝血药物、抗血管内皮生长因子等［6-8］，其中最常见的是抗代谢药物，代表药物有丝裂霉素，具有抑制纤维增殖、抗滤过泡瘢痕形成的作用［2］，普遍的给药方式是手术中将浸有药物的棉片置于巩膜瓣上及巩膜瓣下。大蒜素是从大蒜的球茎中分离出的一种化合物，化学名称为三硫二丙烯，是大蒜的主要有效成分。大蒜中本没有大蒜素，在大蒜被压碎时，激活了蒜氨酸酶，催化分解蒜氨酸生成了大蒜素。大蒜素有抑制血小板聚集、保护血管防止动脉硬化的作用。研究表明大蒜素的这些作用可能与TGF-β1及其信号转导途径有关［9］。大蒜素还有抗氧化的作用，通过减少活性氧的产生和脂质过氧化，进而缓解组织氧化的压力［10］。大蒜素可通过多种机制抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡［3］。研究表明大蒜素能通过Wnt信号的活化，促进 β-catenin降解，将细胞阻滞于G0/G1期，抑制细胞增殖［11］的机制和丝裂霉素抑制纤维细胞增殖的机制相似。
    本研究中我们选用兔作为模型动物，主要是因为兔眼球体积大，手术容易操作，且价格便宜，并且兔眼滤过性手术后伤口愈合情况与人青光眼术后相似。本研究中各组组内眼压术后较术前明显降低，证实青光眼手术成功。随着时间的变化，各组眼压逐渐升高，术后28 d 眼压结果提示生理盐水组比大蒜素组和丝裂霉素组升高快。此结果与 Memarzadeh等［12］和Li等［13］的研究相似。术后大蒜素组仅部分出现轻微的结膜充血，炎性细胞浸润较少。说明大蒜素应用于小梁滤过术中毒副作用小，更安全。术后生理盐水组的滤过泡面积减小速度比大蒜素组和丝裂霉素组更快，提示大蒜素和丝裂霉素可有效维持术后滤过泡的存活时间。术后28 d病理检查结果显示大蒜素组结膜上皮均完整无破损及增厚，大蒜素组和丝裂霉素组滤过区成纤维细胞及胶原纤维疏松，结膜及巩膜间隙较宽。生理盐水组可见滤过区成纤维细胞及胶原纤维致密，结膜及巩膜间隙较窄，形成瘢痕组织。说明大蒜素与丝裂霉素有相同的功效，都在一定程度上抑制细胞增殖，对功能性滤过泡有一定的维持作用，并有望替代丝裂霉素用于临床。