《眼科新进展》  2018年7期 620-624   出版日期：2018-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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小鼠视网膜体外电转化及Transwell体外培养的方法


    电转化技术是利用高强度电场，使细胞膜通透性瞬时增大，从而将DNA、RNA等遗传物质通过细胞孔道导入细胞^［1］。该技术已经应用于多种动物及多个部位。2004年，Matsuda等^［2］采用电转化技术将DNA快速转入大鼠及小鼠视网膜，50 d后仍观察到绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达。此后，研究者对关键条件进行摸索和改进，利用该技术进行视网膜相关基因的功能、视网膜发育及疾病研究。视网膜体外培养是分离视网膜，并让视网膜在特定培养基中长时间存活并发育的技术^［3-6］。1989年，Caffé等^［7］开发了一种方法，将视网膜的光感受器层朝下放在由硝酸纤维素滤膜和聚酰胺纱网做成的小筏上进行培养。自此该方法经过不断改进，应用于药物治疗效果和物质潜在毒性的评估性研究中。此外，视网膜体外培养系统可以模拟器官的功能动力学，在体外培养过程中观察到视网膜的改变，成为研究视网膜形态和功能的重要方法，并且应用于不同的物种中^［8-11］。
    2006年，Donovan等^［12］介绍了视网膜体外电转化结合体外培养的方法，该方法将视网膜体外电转化和视网膜体外培养技术结合起来，可以方便快捷地研究基因的功能。目前国内文献未见对该方法的介绍。本文主要介绍了小鼠视网膜的分离、体外电转化及体外培养的方法，详细描述了操作过程及注意事项，为视网膜相关基因的功能研究提供了可行的方法。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　成年ICR小鼠，雌雄各10只，体质量20~25 g，购于四川大学华西医院动物中心，交配繁殖得到新生小鼠用于研究。
1.1.2　主要试剂及仪器　真核表达质粒pEZ-M90（携带GFP）购于美国Genecopoeia公司，Plasmid Maxi Kit购于美国Qiagen公司，45°弯镊（DUMONT #5/45）购于瑞士DUMON公司，Neurobasal（神经元基础）培养基（21103-049）、DMEM/F12培养基（11330-032）、N2 supplement（N2细胞培养添加剂；17502-048）、B27 supplement（B27细胞培养添加剂；17504-044）、抗生素和抗真菌剂（15240-096）购于美国Thermo Fisher公司，8-对氯苯硫基环腺苷酸（8-cpt-cAMP；ab120424）、Rhodopsin抗体（AB5417）及驴抗小鼠IgG-488抗体购于美国Abcam公司，热灭活胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于以色列BI公司，Transwell小室（PICM03050、PICM01250）及（#3450、#3460）分别购于美国Millipore公司和美国康宁公司，包埋剂购自日本Tissue-Tek公司。电转化仪（NEPA21）购自日本NEPA GENE公司，CO₂培养箱（3111）购于美国Thermo Fisher公司，荧光显微镜（TE2000U）购于日本尼康公司，冰冻切片机（Leica CM 1850）购于德国徕卡公司。
1.2　方法
1.2.1　培养基准备　10 mL神经元基础培养基，8 mL DMEM/F12培养基，200 μL N2细胞培养添加剂（100×），400 μL B27细胞培养添加剂（50×），40 μL 8-对氯苯硫基环腺苷酸（1000×），400 μL抗生素和抗真菌剂（100×），2 mL 热灭活FBS。培养基配制混匀后，滤膜过滤后分装备用。不同文献也报道了不同的培养基成分，可以根据需要进行选择^［12-14］。
1.2.2　质粒提取　利用热击法将pEZ-M90转入DH5α感受态细胞，小量活化后转大瓶培养，使用Plasmid Maxi Kit试剂盒提取质粒DNA，最后溶解DNA至终浓度为1 g·L^-1。
1.2.3　视网膜的分离　用体积分数70%酒精消毒手术器械，并处死新生小鼠，进行眼表消毒，取出眼球，放入培养基中。(1)在解剖显微镜下，先用针头从角巩膜缘扎一个小孔，然后用维纳斯剪轻轻从小孔沿着角巩膜缘向两边剪开，去除角膜。用两把DUMONT弯头尖镊小心地把巩膜撕开，从而得到连着晶状体的视网膜。(2)把视网膜翻转，使视神经方向朝上，用镊子去掉视神经，将一把DUMONT弯头尖镊的一边轻轻插到视神经孔中，然后夹紧固定眼球，另一把DUMONT弯头尖镊夹住巩膜向两边轻轻撕开，也可以得到连着晶状体的完整视网膜。用镊子去掉晶状体，得到完整的视网膜。
1.2.4　体外电转化　用移液器吸头将视网膜转移到培养皿中，在视网膜上滴加100 μL质粒溶液，将直径10 mm的镊子状电极放入质粒溶液中，将视神经节层对电极正极，光感受器层对电极负极，注意电极不要接触视网膜。共进行5次脉冲，电压25 V，时间50 ms，每2次脉冲间隔950 ms。电转化后将视网膜转移到Transwell小室铺片培养。
1.2.5　视网膜的铺片　视网膜转移比较关键，可以将200 μL吸头的前段剪断，用加样器连同培养基一起转移到Transwell小室；或者用前端是弧形的镊子，将视网膜连同1滴培养基一起转移到Transwell小室，以免损伤视网膜。视网膜神经节细胞层向上，视网膜色素上皮层贴在Transwell膜上，用维纳斯剪将视网膜平均剪四刀，类似四叶草型，将视网膜平铺在Transwell小室中。视网膜要保持湿润，让视网膜浸在培养基中，尽量减少平铺过程中的损伤。
1.2.6　视网膜的培养、固定、包埋、切片及荧光观察　将Transwell小室放入孔板中，12孔板每孔加600 μL培养基（6孔板每孔加1.3 mL培养基），使小室周围的液面刚刚超过膜的水平面。培养基的量是关键因素，液体太多或太少都会引起视网膜缺氧死亡。每天往视网膜上滴加20 μL培养基，让膜上面的培养基和下面的培养基建立互通，更利于视网膜的生长。将孔板放入CO₂培养箱，37 ℃培养1~2周，培养基每3 d更换一次，每次更换三分之一或二分之一。培养结束后，加入40 g·L^-1多聚甲醛固定30 min，转移到1.5 mL EP管中，PBS清洗3遍后，300 g·L^-1蔗糖脱水30 min，OCT包埋后冰冻切片。切片用PBS洗涤3次，加入Rhodopsin一抗（1∶1000）4 ℃过夜孵育，第2天用PBS洗涤3次，孵育驴抗鼠IgG-488二抗（1：2000），室温1 h，PBS洗涤3次，DAPI染色后封片，荧光显微镜下照相。
2　结果
2.1　体外电转化及视网膜体外铺片　体外电转化示意图见图1。培养基加在孔板中，视网膜上面滴加少量培养基。培养前后视网膜形态完整。安放在6孔板内的Transwell小室，直径为30 mm，每个Transwell小室中可铺放4~6个视网膜（图2）。




2.2　体外培养的视网膜免疫荧光染色　视网膜在体外培养10 d后进行固定、包埋及切片，使用Rhodopsin抗体进行视杆细胞染色，DAPI进行细胞核染色。结果显示视网膜各层形态完好，视杆细胞排列整齐（图3）。
2.3　电转化后GFP在视网膜外核层中的表达　电转化将pEZ-M90转入视网膜，体外培养7 d后，在视网膜中检测到GFP荧光表达（图4）。GFP主要在视网膜外核层（outer nuclear layer，ONL）中表达，内核层（inner nuclear layer，INL）和神经节细胞层（ganglion cell layer，GCL）被转化的细胞相对较少。




3　讨论
    本文介绍了一种视网膜体外电转化及体外培养的方法，该方法通过高压脉冲将外源基因导入离体的小鼠视网膜，并对其进行体外培养，模拟视网膜在体内的发育进程，是研究视网膜相关基因功能的方法之一。大多数针对视网膜的研究使用条件性敲除小鼠，一般使用视网膜特异表达的CRE小鼠系，仅仅影响视网膜发育和视力，而不影响动物的存活和生殖^［15］。但是有一些基因不仅调控视网膜发育，还调控胚胎其他重要的发育及生理过程，因此这些基因敲除和转基因动物具有胚胎或围产期致死表型，无法进行视网膜发育的体内研究^［16］。例如在 E13.5、RB-/-胚胎会因为造血缺陷和胎盘缺陷在子宫内死亡^［17］。为了克服这个限制，研究人员建立了一个胚胎或围产期视网膜体外培养的方法，该方法不仅可以分析小鼠胚胎致死表型的视网膜，而且可以代替一些视网膜动物模型（避免手术对视网膜的机械损伤），还能进行一些在体内无法完成的复杂药理和遗传操作^［18-19］。对于小鼠来说，从胚胎E15.5 d后就可以进行视网膜体外培养，但是早于E15.5 d很难分离视网膜。视网膜体外培养可连续2周，且没有明显的细胞死亡，因此这种方法有利于研究小鼠胚胎致死突变的视网膜发育及相关基因^［12-13］。在本研究中，主要是进行的P0 d小鼠视网膜体外电转化及培养，并检测外源GFP基因的表达，证实该方法可以用来研究光感受器细胞相关基因功能。根据不同的研究目的，按照小鼠视网膜各类细胞发育的时间段，选择合适的培养时间，以便得到更好的研究结果。相对于病毒感染等其他基因导入方式，电转化方法具有一定的优势^［2，20］。该技术安全性高、用时快；可同时转入多个基因进入细胞等。视网膜体外电转化与活体电转化相比，避免了视网膜下注射步骤，视网膜损伤更小，形态更完整。视网膜体外培养和体内视网膜发育相似，所有的细胞类型也都是按照正确的顺序和比例生产。此外，细胞可以正确层叠，分化的细胞可以表达特征性的分化标记，包括突触蛋白和细胞骨架蛋白^［21-23］。另外的优势是，容易进行遗传学和药理学的操作，本研究中结合电转化技术，对培养的视网膜进行基因表达调控，研究基因与视网膜发育的关系^{［2，12，24］}；在药理学研究中，方便进行神经毒素、通道阻滞剂、代谢标记标记物、小分子药物等研究，比较容易快速地鉴定出与之相关的关键基因^［24-28］。
    电转化技术也具有外源基因表达时间短、少数细胞会损伤及炎症反应等缺点^［12］。同样，视网膜体外培养方法也存在一些问题，视网膜体内发育与体外培养还不完全一致，在视网膜体外培养过程中，神经节细胞发育正常，但是多数只能持续存活10~12 d。此外，很难重复体内的神经节细胞轴突生长情况，光感受器外节不能完全成熟发育。胚胎期视网膜体外培养一般缺乏星形胶质细胞，出生后视网膜的体外培养存在少量星形胶质细胞。最后是Müller细胞的增殖也不同，取决于最初体外培养的时间点和分离视网膜所用的时间^［12］。
    在该方法的使用中，应注意以下几点^［12-13］：（1）电转化时电极插在质粒液体中，不要接触到视网膜；（2）电压比活体视网膜电转化的低一些；（3）分离视网膜时尽量不要撕裂视网膜，尤其要注意去除晶状体时，对于来源困难的视网膜更要注意；（4）体外培养基需要添加一些生长因子，是视网膜体外生长所必需的，尤其是对最初5~7 d的培养更为重要；（5）在培养过程中，每天滴加培养基“饲喂”视网膜，保证视网膜的湿润，防止干燥缺氧；（6）培养过程中需要无菌操作，以防止污染，被污染的视网膜一般边缘模糊，不能使用。如果培养基颜色改变，或者变混浊，可能就会被微生物污染；如果是细菌污染，可能是抗生素（青霉素、链霉素）的过期或降解；如果是酵母污染，可能表明在整个过程中没有保持无菌状态。
    综上所述，视网膜体外电转化及体外培养是高效、快速地研究视网膜基因功能的方法，在整个操作过程中，成功的重要因素是速度及连贯性，避免对视网膜的物理伤害及污染。一般经过训练即可进行操作，有经验的操作者可以成功地将视网膜体外培养长达2~3周，可以达到研究基因功能的目的。