《眼科新进展》  2018年7期 611-615   出版日期：2018-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

---

补肾益精方对先天性视网膜色素变性RCS大鼠感光细胞凋亡的抑制作用


    视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是严重的遗传性致盲眼病，目前关于RP的防治除干细胞、基因治疗、神经保护外，中医药治疗日益受到关注^［1-3］。补肾益精方是我们治疗RP的临床经验方，前期动物实验研究显示其对先天性RP模型RCS大鼠具有一定的保护作用^［4］，为进一步明确其作用机制，本研究以 RCS大鼠作为研究对象，观察补肾益精方对大鼠视网膜感光细胞凋亡的影响作用，从而为临床中药治疗RP提供客观依据和理论支持。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物及分组　取健康SD大鼠12只，SPF级，3周龄，雄性（北京维通利华实验动物技术有限公司提供）；先天性RP模型RCS大鼠24只，SPF级，3周龄，雄性（中国医学科学院医学实验动物研究所提供）。采用随机数字表法将24只RCS大鼠随机分为补肾益精方组及蒸馏水组，每组12只。补肾益精方组给予补肾益精方药液灌胃（8.8 g·kg^-1），每天1次，蒸馏水组给予同等量的蒸馏水灌胃，给药7 d及28 d后每组按随机数字表法选取6只大鼠进行指标检测，健康SD大鼠常规饲养作为正常组。实验遵循国家实验动物管理保护条例。
1.1.2　实验试剂及仪器　补肾益精方方药组成主要包括何首乌、黄精、枸杞子等，水提浓缩药液由中国中医科学院眼科医院药学部制备而成，浓度880 g·L^-1。Trizol^?Reagent RNA 提取试剂盒（美国 Life Technologies Corporation），无水乙醇、异丙醇、氯仿均为分析纯（北京化学试剂公司），M-MLV Reverse Transcriptase cDNA第一链合成试剂盒（美国 Invitrogen公司），Real Master Mix（SYBR Green）（北京天根生化科技有限公司），Recombinant DNase I（日本 TAKARA公司）。Life-Tech 7500实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司），Nanodrop 2000超微量紫外分光光度计（美国Thermo Fisher公司），RM2245轮转式切片机、DM2500荧光显微镜（德国Leica公司）。
1.2　方法
1.2.1　HE染色观察各组大鼠视网膜组织病理学变化　水合氯醛麻醉过量处死大鼠，快速取出右眼眼球，40 g·L^-1多聚甲醛溶液固定，脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋，垂直视网膜行4 μm切片，苏木素-伊红染色；光学显微镜下观察视网膜各层结构变化并拍照，计数视盘两侧各50 μm长度外核层细胞核数，进行统计学分析。
1.2.2　TUNEL法检测细胞凋亡情况　水合氯醛麻醉过量处死大鼠，快速取出右眼眼球，制作石蜡切片。按照TUNEL试剂盒说明进行检测，DAPI复染，荧光显微镜下观察，每组随机选取6张片子，每张片子计数两个视野中发生凋亡感光细胞数及感光细胞总数，计算细胞凋亡率=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100 %。
1.2.3　实时荧光定量PCR检测视网膜中神经营养因子表达　水合氯醛过量麻醉处死大鼠，快速取出左眼眼球，分离新鲜视网膜，采用Trizol试剂盒提取视网膜总RNA，紫外分光光度计测定浓度，-20 ℃保存。应用逆转录试剂盒合成cDNA，紫外分光光度计测定其浓度，-20 ℃保存。PCR反应体系10 μL：1 μL cDNA、200 nmol·L^-1引物和 Real Master Mix 混合物 （BioRad）；反应条件：95 ℃预变性5 min，然后95 ℃15 s，60 ℃ 15 s及72 ℃ 15 s，进行45个循环。睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）上游引物：5’-TGACTGAGGCAGAGCG-3’，下游引物：5’-AGGCAAAGGCAGAAAC-3’；碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）上游引物：5’-CGGCTGCTGGCTTCTA-3’，下游引物：5’-TGCCCAGTTCGTTTCAG-3’；脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）上游引物：5’-TGGATGAGGACCAGAAG-3’，下游引物：5’-AAAGAGCAG AGGAGGC-3’。β肌动蛋白基因作为内参照，上游引物：5’-AATGAGGCTGGTGATAAA-3’，下游引物：5’-GCAAAGAGGGCAAGAA-3’。每个数据重复测量3次。
1.3　统计学方法　采用GraphPad Prism 5（美国 GraphPad 公司）软件进行统计分析，数据以x?±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，显著性水平α=0.05。
2　结果
2.1　各组大鼠视网膜组织病理学改变　光学显微镜观察，大鼠视网膜切片HE染色可见正常组SD大鼠视网膜结构清晰，层次分明，各层细胞排列整齐。蒸馏水组大鼠视网膜内核层及外核层均较正常组明显变薄，细胞排列稀疏，可见空泡样改变，感光细胞数减少，且随鼠龄增加减少日益显著。补肾益精方组大鼠视网膜内核层及外核层亦较正常组变薄，但与蒸馏水组相比增厚，感光细胞数较后者增多，细胞排列也较为整齐。统计学分析显示，给药7 d时正常组、补肾益精方组及蒸馏水组每个高倍视野感光细胞数总体差异有统计学意义（P<0.05），两两比较正常组大鼠感光细胞数明显高于蒸馏水组（P<0.05）及补肾益精方组（P<0.05），补肾益精方组感光细胞数明显高于蒸馏水组，差异有统计学意义（P<0.05）。给药28 d与给药7 d趋势相似，见表1。



2.2　TUNEL法检测各组大鼠视网膜细胞凋亡情况　给药7 d及14 d后正常组大鼠视网膜均未见凋亡细胞，蒸馏水组及补肾益精方组大鼠视网膜感光细胞层出现明显的凋亡现象。给药7 d时蒸馏水组大鼠视网膜感光细胞层细胞凋亡率为50.34%±5.21%，补肾益精方组为31.67%±5.39%，补肾益精方组感光细胞凋亡率明显低于蒸馏水组，差异有统计学意义（P=0.00）。给药28 d时，蒸馏水组大鼠视网膜感光细胞层细胞凋亡率为44.02%±7.17%，补肾益精方组为29.68%±4.31%，补肾益精方组感光细胞凋亡率明显低于蒸馏水组，差异有统计学意义（P=0.01）。见图1。
2.3　实时荧光定量PCR检测视网膜组织中神经营养因子表达情况　CNTF检测结果显示，在给药7 d及28 d时蒸馏水组及补肾益精方组大鼠视网膜CNTF mRNA表达水平均较正常组降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；补肾益精方组表达较蒸馏水组均明显增加，差异均有统计学意义（均为P<0.05），见图2。
    BDNF检测结果显示，在给药7 d及28 d时蒸馏水组及补肾益精方组大鼠视网膜BDNF mRNA表达水平均较正常组降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；在给药7 d时补肾益精方组与蒸馏水组相比，表达明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；但在给药28 d时，补肾益精方组与蒸馏水组相比，差异无统计学意义（P=0.25），见图3。
    bFGF检测结果显示，在7 d及28 d时蒸馏水组及补肾益精方组大鼠视网膜中bFGF mRNA表达均较正常组明显增加（均为P<0.05），但前两组比较，给药7 d及28 d的差异均无统计学意义（均为P>0.05），图4。




3　讨论
    RCS大鼠的视网膜色素上皮细胞受体酪氨酸酶Mertk基因发生隐性突变，第409碱基对缺失，致使视网膜色素上皮细胞内参与结合脱落视杆外节膜盘的蛋白合成发生改变，不能正常发挥其吞噬功能，脱落膜盘大量堆积于视网膜下腔，继而导致感光细胞渐进性变性死亡及视觉功能障碍^［5］。RCS大鼠生后2周表现正常，22 d时光感受器细胞开始减少，从后极部开始逐渐波及至周边视网膜，3个月时绝大部分光感受器细胞消失^［6］。由于RCS 大鼠与人类RP在病因及病程进展等方面有较多相似之处，几十年来，被广泛用于RP视功能挽救和重建策略的研究中，本实验选择3周龄RCS大鼠作为实验动物模型进行观察。
    现代医学认为RP是基因突变导致的视网膜退行性疾病，在中医经典古籍中RP亦早有记载，被称为“高风雀目”，中医理论认为其主要病因为先天禀赋不足，这与现代眼科对RP的认识接近。目前RP的确切发病机制尚不完全清楚，但是大量研究已证实细胞凋亡是该病发生发展的重要分子机制，因此采用药物或其他方法阻止或延缓细胞凋亡的发生对RP具有防治作用^［7］。中医对RP的治疗以纠正亏虚为根本，补肾益精方是由我院唐由之研究员根据多年临床经验总结而得，方药组成包括制何首乌、黄精、枸杞子等，临床观察发现其对RP患者病情有一定的稳定作用。我们前期动物实验采用病理、眼电生理方法观察发现补肾益精方对RCS大鼠视网膜变性具有较好的保护作用^［4］。现代药理学研究显示何首乌对淀粉样β蛋白所致的脑内神经元细胞具有保护作用^［8］；黄精中的有效成分黄精多糖可以抗缺氧性的神经细胞凋亡^［9］；枸杞子提取液对单眼视觉剥夺性弱视大鼠视网膜细胞具有保护作用，亦对RCS大鼠早期视网膜变性具有保护作用^［10-11］。虽然上述研究中的细胞种类不同，但提示由上述中药组成的补肾益精方对神经细胞具有保护作用。本实验结果显示，补肾益精方组感光细胞的凋亡率明显低于蒸馏水组，同时HE染色病理结果发现补肾益精方组RCS大鼠视网膜保留较多的感光细胞，初步证实补肾益精方可以抑制RCS大鼠感光细胞的凋亡。
    影响细胞凋亡的因素很多，近年来研究证实神经营养因子对神经细胞有重要的保护作用^［12］。因此，为进一步探讨补肾益精方对感光细胞凋亡的抑制作用，我们本次研究还观察了补肾益精方对神经营养因子家族中的CNTF、BDNF及bFGF在视网膜表达的影响，结果发现补肾益精方对上述神经营养因子表达有不同的促进作用，其中对CNTF的作用最强，在给药7 d及28 d补肾益精方组视网膜CNTF的表达均明显高于蒸馏水组，对BDNF作用次之，对bFGF作用不明显。CNTF是细胞因子家族中被研究最多的成员，目前已在至少13 种不同的动物模型中得到证实CNTF可以有效延缓RP进程^［13］。Lipinski等^［14］研究表明，在RP鼠模型中由腺相关病毒介导的CNTF持续性分泌可以对感光细胞发挥保护作用。BDNF是一种由脑组织合成并广泛分布于中枢神经系统的小分子碱性蛋白。研究发现，BDNF对视网膜神经节细胞、视网膜感光细胞和视网膜色素上皮细胞均有保护、营养及抗凋亡作用^［15］。玻璃体内注射BDNF可以改善RP小鼠的超微结构，从而延缓视网膜变性进程，其作用可能与视网膜上c-jun蛋白表达增加有关^［16］。因此，我们推测补肾益精方可能通过促进视网膜CNTF及BDNF的表达，抑制感光细胞凋亡，从而延缓RCS大鼠视网膜变性的发展。
    综上所述，通过本实验我们发现补肾益精方对RCS大鼠视网膜感光细胞的凋亡具有抑制作用，其作用机制可能与促进视网膜神经营养因子的表达有关。