《眼科新进展》  2018年7期 606-610   出版日期：2018-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

---

玻璃体内注射双调蛋白抗体对透镜诱导型近视豚鼠屈光度、眼轴长度及视网膜中双调蛋白表达的影响


    近视作为全球性健康问题，与视觉缺陷和诸多致盲并发症密切相关^［1］。随着电子产品的普及，近视的患病率越来越高，且低龄化趋势日益明显，预防和控制近视发生发展迫在眉睫。基因和环境两大因素能够控制眼球生长，影响近视的形成和发展^［2］。最新研究发现^［3］，双调蛋白（amphiregulin,AREG）基因的变异与亚裔人群的受教育程度和近视发病情况密切相关，提示AREG可能参与近视的发生发展。AREG蛋白首次在乳腺癌细胞中发现并分离，是表皮生长因子受体的唯一配体，既可以介导体外纤维母细胞增殖和分化，又可抑制正常表皮细胞和侵袭性肿瘤细胞系的细胞因子表达，因其具有双向调控作用，故命名为双调蛋白^［4］。目前，关于AREG与近视关系的基础研究开展较少，AREG参与近视发病的具体机制需要进一步实验验证。本实验采用玻璃体内注射AREG抗体法，观察注射后负透镜诱导型近视豚鼠屈光度和眼轴长度及视网膜中AREG mRNA和蛋白表达的变化。
1　材料与方法
1.1　实验动物和分组　选取2周龄健康英国三色短毛豚鼠30只（购自河南康达实验动物有限公司），平均体质量110 g，适应性饲养3 d后，随机分为正常对照组、近视组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组6只。入组前对各组豚鼠眼部进行筛查，排除白内障、先天性近视、角膜疾病等常见眼部疾病，测量各组豚鼠眼球屈光度及眼轴长度，各组实验前屈光度及眼轴长度差异均无统计学意义（均为P>0.05），见表1。饲养温度保持25 ℃左右，控制12 h/12 h的昼夜规律，自由饮食。
1.2　动物模型制作　从第1周开始，除正常对照组外，其余组均右眼戴-10.0 D透镜，左眼作为自身对照与正常对照组均不做任何处理，戴镜2周后分别测量各组的屈光度及眼轴长度，观察近视造模情况。第3周开始，近视组豚鼠右眼玻璃体内注射Linger注射液3 μL，低剂量组、中剂量组、高剂量组豚鼠右眼分别注射500 mg·L^-1 AREG抗体（R&D：MAB989-500）1 μL、2 μL、3 μL，对侧眼作为自身对照，不做任何处理，每周注射1次，连续注射3周，期间继续配戴眼镜，3周后测量屈光度和眼轴长度。
1.3　屈光度和眼轴长度的测量　豚鼠双眼结膜囊内滴复方托吡卡胺滴眼液（日本参天制药有限公司）4次散瞳，每次间隔5 min，最后一次滴完等待20 min，在暗室用带状光检影镜进行检影（工作距离保持0.5 m），屈光度为垂直及水平两条主要子午线检测值的平均数。测量眼轴长度时用盐酸奥布卡因滴眼液2次（日本参天制药有限公司）行眼球表面麻醉，眼科A/B波超声仪（法国Quantel Medical 公司）探头垂直于角膜平面，对准瞳孔中心，连续测量10 次，剔除明显偏离的数值取平均值，该过程前后均由同一技师操作完成。设置A 型超声在不同介质中的传播速度，前房为1557 m·s^-1，玻璃体为1540 m·s^-1，晶状体为1723 m·s^-1［5］。
1.4　玻璃体内注射方法　提前1 d常规抗生素滴眼液滴右眼（每天6次），术前散瞳，50 g·L^-1水合氯醛腹腔注射麻醉，眼周碘伏消毒完毕后铺无菌洞巾，聚维酮碘滴眼液消毒眼表，1 min后用氯化钠注射液进行冲洗。在显微镜下用显微镜齿镊固定眼球，微量注射器在颞侧角膜缘后1 mm处垂直巩膜进针，针头向眼球壁倾斜20°避开晶状体后推进约3 mm注射抗体，注射完毕后用齿镊轻轻夹住针孔30 s，抗生素眼膏涂眼，无菌纱布遮盖包扎，控制室温约25 ℃保暖，术后第2天抗生素滴眼液滴右眼（每天6次），连续2 d，继续负透镜诱导。
1.5　实时荧光定量PCR法检测豚鼠视网膜中AREG mRNA的表达　将豚鼠腹腔注射过量水合氯醛麻醉处死，立刻摘取眼球，沿角膜缘剪开，去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体、巩膜，分离视网膜称质量，液氮速冻，-80 ℃保存备用。视网膜组织总RNA 的提取和实时荧光定量PCR按照经典方法进行^［6］。采用紫外分光光度计（北京凯奥公司）测量RNA的吸光度（A）值，A₂₆₀/A₂₈₀为1.8～2.0。采用Transcriptor first strand cDNA synthesis kit（美国Roche 公司）试剂盒合成cDNA，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，AREG上游引物：5’-CTCGGCTCAGGCTGTTATGTCG-3’，下游引物：5’-GTAGCCCAGCGTTGCCAGTTCAG-3’，产物大小为222 bp。应用β-actin为内参，对各组豚鼠视网膜中AREG的mRNA 相对表达量进行定量分析；上游引物为：5’-ACCCCAAGGCCAACCGTGAGAAGATG-3’，下游引物为：5’-CTCGGCCGTGGTGGTGAAACTGTAGC-3’，产物大小为284 bp。实时荧光定量PCR通过Quantity One程序对结果进行统计分析，得到各组PCR的Ct值，采用△△Ct法计算AREG mRNA表达的强弱。
1.6　免疫荧光标记法检测豚鼠视网膜中AREG蛋白的表达　将保存备用眼球矢状位冷冻包埋，制备6 μm厚的冷冻切片，置室温8 min后用4 ℃丙酮固定10 min，以备荧光标记。切片用PBS冲洗5 min×3次，3 g·L^-1 Triton X-100室温孵育20 min，经PBS漂洗后，体积分数10%山羊血清白蛋白室温封闭20 min，1∶100稀释AREG抗体（bioss-3847R），4 ℃孵育过夜。第2天PBS洗5 min×3次，滴加荧光二抗羊抗兔（1∶400）（abcam-150078）室温避光2 h，PBS洗5 min×3次，DAPI（索莱宝生物技术有限公司C0065）室温避光孵育20 min，PBS洗5 min×3次，抗荧光淬灭剂（碧云天生物技术有限公司P0-128）封片，利用激光共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）观察，AREG发出555 nm的红色光，DAPI发出633 nm的蓝色光。观察眼球赤道部、赤道部与后极部之间和后极部视网膜中AREG蛋白的分布并保存图像。
1.7　统计学方法　采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计分析，实验各项数据经W检验呈正态分布，数据采用x?±s表示，Levene检验各组各指标方差齐性。两组间比较采用独立样本t检验，右眼与左眼比较采用配对资料t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　各组豚鼠屈光度及眼轴长度的变化　入组前各组豚鼠的初始屈光度及眼轴长度差异均无统计学意义（均为P>0.05）；与正常对照组相比，透镜诱导2周后近视组、低剂量组、中剂量组、高剂量组豚鼠右眼屈光度下降，眼轴延长（均为P<0.05）；各组左眼屈光度和眼轴长度差异均无统计学意义（均为P>0.05）。玻璃体内注射AREG抗体3次后，与近视组相比，低剂量组屈光度和眼轴长度差异均无统计学意义（均为P>0.05）；中剂量组屈光度差异无统计学意义（P>0.05），但眼轴缩短，差异有统计学意义（P<0.01）；高剂量组屈光度上升且眼轴缩短，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；各组对侧眼的屈光度和眼轴长度差异均无统计学意义（均为P>0.05），见表1。
    玻璃体内注射AREG抗体3次后，对各组豚鼠右眼与左眼眼轴长度和屈光度差值进行分析，低剂量组、中剂量组、高剂量组与近视组相比，眼轴长度呈剂量依赖性缩短，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；屈光度呈剂量依赖性上升，其中高剂量组屈光度与近视组相比差异有统计学意义（P<0.01），见表2。





2.2　各组豚鼠视网膜中AREG蛋白的表达　免疫荧光标记法在各组豚鼠眼球后极部、赤道部以及后极部与赤道部之间的视网膜均检测到AREG蛋白，说明AREG主要分布在眼球视网膜组织，且无部位特异性。AREG蛋白在近视组豚鼠视网膜中高表达，正常对照组低表达，玻璃体内注射AREG抗体后低剂量组、中剂量组和高剂量组AREG蛋白表达逐渐下降（图1）。
2.3　各组豚鼠视网膜中AREG mRNA的表达　将正常对照组视网膜中AREG mRNA表达量标准化为100%，近视组、低剂量组、中剂量组、高剂量组右眼AREG mRNA表达量分别与标准化后的正常对照组比较得到目的基因的相对表达量。近视组AREG mRNA相对表达量最高，正常对照组其次，低剂量组、中剂量组和高剂量组AREG mRNA的表达呈剂量依赖性下降（图2）。



3　讨论
    当前近视人群逐步扩大，高度近视的发病年龄呈低龄化。促使近视眼屈光度下降的因素很多^［7］，主要包括角膜系统、晶状体系统、眼轴延长等。其中眼轴延长是影响眼屈光状态的决定性因素，眼轴长度增加能够直接导致眼球近视化^［8-9］。矫正近视的主要手段有框架眼镜、角膜塑形镜、角膜接触镜、屈光手术、后巩膜加固术等，但这些方法都只改变屈光度，不能阻止近视眼患者眼轴长度增加。随着生命科学与基因技术的飞速发展，人类对疾病的认识更加深入，科学家们发现基因的结构或功能改变与诸多疾病的发生发展密切相关，关于基因治疗的研究大量开展，通过遗传学筛选易感基因，并精确治疗逐渐成为一种趋势。
    研究证实生长因子具有调控眼球生长、加快神经系统功能恢复等诸多作用。目前研究发现与近视相关的生长因子主要有表皮生长因子^［10］、转化生长因子^［11］、成纤维细胞生长因子^［12］、胰岛素样生长因子^［13］、神经生长因子^［14］、肝细胞生长因子^［15］等。AREG为表皮生长因子家族的重要组成部分，是表皮生长因子受体的唯一配体，近年来研究发现，AREG基因的变异与亚裔人群的受教育程度和近视发病情况密切相关^［3］，但AREG具体参与近视疾病的机制需要进一步研究。
    本实验首次采用负透镜诱导型近视豚鼠玻璃体内注射AREG抗体，观察其对近视豚鼠屈光度及眼轴长度的影响。研究发现AREG在眼球主要分布在视网膜组织中，且无部位特异性，注射AREG抗体能够明显抑制近视豚鼠眼轴延长和屈光度下降，且呈剂量依赖性。检测视网膜AREG的蛋白和mRNA发现，注射AREG的抗体后，AREG的蛋白和 mRNA表达均下降，说明AREG抗体具有负反馈调节作用，能够影响内源性mRNA下调，具有持续效应。总而言之，AREG与近视疾病密切相关，抑制AREG因子能够阻止近视进展，具有临床价值，未来可以考虑研究AREG特异性抗体或干预AREG基因，抑制近视疾病的发生发展，消除轴性近视并发症，但具体效果还需要进一步研究。