《眼科新进展》  2018年2期 197-200   出版日期：2018-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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Exosome在眼底疾病中的研究新进展


    外泌体（exosome）自1987年由Johnstone第1次在网织红细胞的胞外细胞质中发现以来，至今已有30余年。因其独特的生物学特征，对其结构、组成、功能的探索已成为多个学科研究的焦点和热点，尤其在肿瘤、心血管、神经系统等方面的研究已经取得了较为丰富的成果^［1-3］。近年来，各种细胞来源的exosome在各类眼底疾病中的作用的研究也在大量开展，本文回顾近年来exosome在眼底疾病中危险因素、发病机制、病理过程、诊断治疗等方面的作用的研究进展，并综述如下。
1　Exosome简介
    Exosome又称外泌体，是一种直径在40~100 nm的微小囊泡，其来源丰富，几乎所有细胞均可分泌exosome。其形成机制为细胞内陷形成一胞内体，胞内体再以出芽的形式形成多个小囊泡，构成多泡体，最终多泡体与细胞膜融合，向外界分泌出这些腔内囊泡，形成exosome^［4］。Exosome成分丰富，其中包含了与分泌细胞结构和功能均密切相关的蛋白质、miRNA以及RNA片段^［5］。早期人们认为exosome只是细胞向外排放代谢产物的一种载体。但随着研究的深入，人们发现不同来源的exosome在不同生理或病理环境下表现出丰富的生物学特征，与多种疾病都有着密不可分的关系。
2　Exosome的生物学特性
    Exosome含有与其分泌细胞密切相关的多种蛋白，因此具有了丰富而特殊的生物学功能，主要体现在以下几个方面。
2.1　基本生物学作用　细胞分泌exosome的过程如同排出代谢产物的过程，但与传统意义上的代谢所不同的是，exosome的释放并不是一个裂解的过程，它含有完整的蛋白及RNA，同时不需要高效的降解能力和特殊的排泄管道^［6］。因此，exsome所携带的这些完整成分可以使得细胞在不需要直接接触下完成细胞间生物信号传导。信号传导是exosome最为基本、也是最为重要的生物学功能。它在不同生理病理状态下的作用，大部分都是基于信号传递这一基本功能来完成的。
2.2　免疫学作用　Exosome可作为一种重要的炎性介质，在应激状态下可以通过相关应激敏感性蛋白及miRNA调控内在免疫系统^［7］；exosome还可以通过表面所黏附的分子而被受体细胞捕获，从而发挥一种类似免疫分子表达或抗原呈递的作用^［8］。但exosome在免疫学方面的作用十分复杂，例如，不同来源的exosome可能发挥抗肿瘤发生或促进肿瘤发生等截然不同的作用。因此对其研究尚需进一步深入开展。
2.3　修复作用　exosome所含有的各类蛋白可在多种损伤性模型中发挥修复作用。如缺血再灌注损伤模型中，exosome可通过其标记性蛋白——热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）来促进缺血器官的血管生成、促进缺血细胞的生存与增殖，从而发挥保护作用^［9］。同样，这种保护和修复作用也在各类神经系统的退行性疾病，如阿尔兹海默症中得到证实^［10］。
2.4　诊断工具　由于exosome含有分泌细胞的特异性内容物，为疾病的检测提供各类特异性的生物学指标。因此exosome在肿瘤检测、妊娠期筛查等领域可用作有效的确诊手段。甚至对于某些敏感基因，在突变早期即可通过exosome所携带的基因检测来发现，从而实现早期诊断^［11］。同时，当肿瘤细胞发生器官转移时，这些生物学指标同样可用于肿瘤的转移检测。
3　Exosome在眼底疾病中的研究进展
     相对于研究成果较为丰富的肿瘤、心血管、神经系统等方面，exosome在眼科领域的研究相对较少，目前主要集中在以下几个方面。
3.1　Exosome在眼底疾病危险因素研究中的作用　吸烟是年龄相关性黄斑病变（age-related macular degeneration，AMD）患者发病的危险因素之一，但其具体病理机制尚不清楚，Wang等^［12］应用exosome标记物的检测来研究AMD患病的危险因素。其采用Benzo(a)Pyrene这一烟草中的有害物质作用于视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE)细胞，之后提取RPE细胞所分泌的exosome，对其进行检测。结果发现CD63、CD81和LAMP2的表达较对照组明显上调，这几类蛋白已经证实与AMD中drusen的形成明确相关，从而证实了烟草中的Benzo(a)Pyrene损伤RPE细胞后，导致其分泌促进drusen形成的蛋白，形成了AMD的早期病变基础，而这一分泌作用就是由exosome来介导实现的。同样的方法可用于明确其他危险因素与疾病发生的关系。
3.2　Exosome在眼底疾病病理机制中的作用研究　Drusen的形成是AMD的一个重要病理过程，但对于drusen形成的原因及其成分并不十分清楚。Wang等^［13］对AMD患者供体眼球的研究结果发现，正常的RPE细胞释放的exosome上具有补体因子H（complement factor H，CFH）的结合位点，正常情况下exosome与CFH结合后可以被机体分解移除。但对于AMD患者，其CFH功能障碍，在与exosome结合后不能被代谢清除，反而导致exosome所携带的细胞内蛋白释放，这些蛋白参与了AMD疾病中drusen的形成。同时Wang等^［14］的进一步研究还发现，AMD患者中明显的自噬作用也导致了RPE所分泌exosome中细胞内蛋白释放，进而参与到drusen形成的病理过程中。因此，exosome在AMD的发生过程中扮演了十分重要的角色。
    Atienzar-Aroca等^［15］将接受活性氧刺激的RPE细胞所分泌的exosome提取分离，检测发现其中所含有的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)的mRNA含量较对照组明显增高。再将这些exosome与血管内皮细胞共同培养，结果发现内皮细胞出芽生长形成新生血管的能力明显增强。从而推测exosome在视网膜组织缺氧后、诱发新生血管形成过程中发挥了VEGF信号传递的作用。Yoon等^［16］对视网膜毛细血管瘤（von hipple-lindau，VHL）发病机制的研究同样也证实了在肿瘤血管成分的形成和增殖过程中，exosome也发挥了信号传导作用。
3.3　Exosome在眼底疾病诊断中的作用　Kang等^［17］对AMD患者前房房水中的exosome进行检测，结果显示组织蛋白酶D（cathepsin D）、细胞角蛋白8（cytokeratin 8）以及其他4种标记蛋白表达明显增加。对这些蛋白的功能研究发现其均与AMD发生过程中的自噬溶酶体途径、上皮细胞与间充质细胞的转化密切相关。因此前房房水中exosome所含的标记蛋白有可能成为AMD患者诊断的标准之一，同时这些目标蛋白也可能成为AMD患者治疗的靶蛋白，这为以exsome为媒介的AMD治疗研究提供了新的思路。
    脉络膜黑色素瘤是临床上并不十分罕见的一类恶性肿瘤，虽然目前已经建立了一套包括影像学、细胞学在内的检测手段，但在特异性和敏感性方面仍存在不足。Ragusa等^［18］选择脉络膜黑色素瘤患者以及健康人群作为对照进行研究，对他们的玻璃体exsome进行分析，检测了其中754种miRNA的表达。发现其中miR-146a的表达明显增高，这种增高不但出现在患者的玻璃体exosome、血清exsome中，甚至还出现在以往经甲醛固定或石蜡包埋的肿瘤组织中。故认为对exosome这一标记物的检测可能成为脉络膜黑色素瘤患者诊断的一个辅助指标。
3.4　Exosome在眼底疾病治疗中的作用
3.4.1　光损伤性疾病　Yu等^［19］研究发现，在激光诱导视网膜损伤动物模型中，玻璃体腔注射间充质干细胞来源的exosome可有效减少细胞凋亡和损伤，从而保护视功能。其进一步机制研究发现，这种保护作用来源于exosome明显下调了单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）的表达，从而有效抑制了激光损伤诱导的炎症反应。
3.4.2　炎症性疾病　Knickelbein等^［20］将RPE细胞来源的exosome用一系列的炎症因子（包括IL-1β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α）进行刺激后，观察其对淋巴细胞、单核细胞等所产生的作用，结果发现炎症因子刺激后的exosome在正常稳定状态下对免疫环境产生下调作用，但在炎症状态下，却能通过杀伤单核细胞来发挥一种潜在的减缓炎症反应的作用。从而证实了RPE细胞来源的exosome的免疫调节作用。
3.4.3　AMD　Hajrasouliha等^［21］研究发现视网膜星形胶质细胞（retianl asctrocyte，RAC）来源的exosome在激光诱导的黄斑区脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）的动物模型中，可有效抑制巨噬细胞的迁移和毛细血管内皮细胞的出芽，从而减少新生血管引发的渗漏，并抑制新生血管的生成。其进一步机制研究证实，RAC来源的exosome含有包括内皮抑素、基质金属蛋白酶在内的抗新生血管成分，因此exosome在湿性AMD、糖尿病视网膜病变等新生血管疾病的研究和治疗中可能具有巨大的潜力。目前抗VEGF药物治疗AMD已经取得了显著的治疗效果，并成为一线治疗手段，但抗VEGF药物注射入玻璃体腔后如何发挥作用等具体的分子机制尚不十分清楚。Aboul等^［22］研究发现抗VEGF药物注入玻璃体腔后，迅速被某些局部区域的RPE细胞摄取，在后续的时间内，逐步以exosome包装的形式释放出来，再被其他RPE细胞摄取。因此推测抗VEGF药物以exosome为载体，在细胞间进行传递来发挥抗VEGF的作用，也证实了这类药物进入玻璃体后呈现一种时间依赖的作用模式。
3.4.4　缺血性疾病　为研究exosome对缺血损伤眼性疾病的作用，Moisseiev等^［23］将间充质干细胞来源的exosome注射入缺氧诱导视网膜病变的小鼠玻璃体腔中，并采用视网膜铺片及光学相干断层扫描进行检查，结果发现治疗组新生血管面积较对照组明显减少，视网膜厚度增加。因此认为间充质干细胞来源的exosome对缺血性视网膜病变具有保护作用。
3.4.5　外伤性疾病　Mead等^［24］分离提取骨髓细胞来源的exosome，并建立视神经挫伤的动物模型，观察每周1次的玻璃体腔exosome注射是否对视神经的损伤发挥保护作用。结果显示21 d后，治疗组较对照组视网膜神经节细胞的数量存活率明显提高，细胞功能障碍得到缓解，神经节细胞轴突的丢失降低。因此骨髓来源的exosome可以对外伤性神经细胞的损伤发挥保护作用。
3.5　Exosome在眼底病中的其他作用　由于眼球特殊的物理学及生物化学屏障，导致各类用于研究或治疗的药物难以大量进入视网膜之内，为相关领域的研究带来了重重困难。因此人们一直在寻找安全、穿透性好、不易被眼内酶降解的载体物质作为理想的运载手段。传统的运载手段腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）虽然具有一定的运载功能，但其扩散性不佳，仅能停留在注射部位的局部区域，同时其安全性也一直备受质疑。Wassmer等^［25］及其团队将AAV包装至exosome中，将exosome-AAV与传统的AAV进行比较，同样通过玻璃体腔注射的方法给药，结果发现exosome-AAV比AAV进入到视网膜更深的层次；同时发现除了RPE细胞外，包括神经节细胞、双极细胞、光感受器细胞在内的多种视网膜细胞均能被exo-AAV所转染，表现出比传统的AAV更多种类的转染细胞谱。同样的结果也在相应的体外实验中得到证实。除此之外，exosome-AAV对眼内各类抗体或酶类消化中和的抵抗力明显提高。exosome之所以表现出以上的优越性，可能与其自身特性有密切关系：exosome作为一种细胞分泌体，分子直径在40~100 μm之间，本身就容易被其他细胞所识别和吞噬。因此，exosome可能为研究者们提供了一种运用前景良好的药物或基因运载工具。
4　结语
    眼底包括RPE细胞、星形胶质细胞在内的多重细胞，在正常或者病理状态下均可分泌exosome，其内含物丰富，与众多眼底疾病均有着密不可分的关系。但exosome在眼底疾病中的研究结果尚处于新兴起步阶段，对于其成分、分子机制等方面的研究还存在较大空间。甚至对于同样来源的exosome在不同病理生理条件下的功能及作用，均需要更加深入的研究。随着对exosome结构及功能认识的深入，其极有可能成为眼科研究及临床治疗的有效工具，在眼底疾病的诊断和治疗中发挥重要作用。