《眼科新进展》  2018年2期 156-160   出版日期：2018-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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单酰甘油酰基转移酶2（MOGAT2）在翼状胬肉组织中的表达及意义


    翼状胬肉是一种常见的眼表疾病，多发生于中老年人，是一种向角膜表面生长的与结膜相连的纤维血管样组织，从病理学角度来看，具有高度的增殖性和侵袭性^［1］。随着翼状胬肉的增大，既影响美观，又可引起散光和视力损害，还会不同程度地限制眼球运动。翼状胬肉的确切病因和发病机制虽然尚未完全明确，但流行病学显示，翼状胬肉的发病主要与年龄、性别、遗传、职业环境及结膜炎症等因素关系密切^［2-3］。另外，紫外线暴露也是一个很重要的发病因素，这可能和紫外线引起的直接光毒性和氧自由基的形成有关^［3-6］。单酰甘油酰基转移酶2（monoacylglycerol O-acyltransferase 2，MOGAT2）是一种蛋白质编码基因，催化2-单酰基甘油和脂酰Co-A形成二酰基甘油，是脂肪消化吸收的关键酶。本研究通过免疫组织化学的方法观察并比较MOGAT2在翼状胬肉组织与正常结膜组织中的表达差异，并分析翼状胬肉中MOGAT2的表达与年龄、性别等影响因素及临床分期间的关系，为进一步探讨翼状胬肉的发病机制和临床治疗提供理论基础。
1　资料与方法
1.1　一般资料　收集2016年9月至12月于我院眼科行翼状胬肉切除术的53例（54眼）患者，翼状胬肉组织标本54例。患者年龄41~75岁，平均年龄58.0岁；男23例，女30例，排除其他眼表疾病。正常结膜组织18例，年龄48~74岁，平均年龄62.0岁；男7例，女11例，其中4例取自行青光眼手术的角巩膜缘球结膜，14例取自翼状胬肉手术术眼球结膜瓣移植片的远端球结膜。术前登记每例患者的临床资料，包括患者的性别、年龄、受教育程度、职业、收入、户外工作时是否配戴眼镜或帽子、抽烟、饮酒、血糖及血压情况、初发或复发、术眼视力，并且术前对患者翼状胬肉进行分期，临床分期的标准：静止期的翼状胬肉头部扁平，较薄，呈膜状；进展期的翼状胬肉充血肥厚，头部隆起，侵及角膜前弹力层及实质浅层。所有入选对象均知晓本次研究，并取得患者知情同意。
1.2　主要试剂与仪器　兔抗MOGAT2多克隆抗体（瑞典Atlas Antibodies公司），抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒（上海基因科技股份有限公司），石蜡切片机（德国莱卡公司），显微镜（日本奥林巴斯公司）。
1.3　制备组织切片　所有翼状胬肉和正常球结膜组织手术切除后立即用体积分数10%甲醛溶液固定，经过脱水、透明、浸蜡后包埋，制成切片，常规HE染色，显微镜下观察，组织定位，每例标本选取1~2个采样点，排成10×7的组织微阵列，共制成2个组织芯片蜡块，随后连续切片，厚度约为4 μm，脱蜡后待用。
1.4　免疫组织化学染色　切片取出后进行免疫组织化学染色。将切片置于预先煮沸的柠檬酸盐缓冲液中，继续煮沸10 min，对切片进行抗原修复，室温自然冷却，PBS洗3次，每次5 min；体积分数3%H₂O₂ 37 ℃孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，PBS洗3次，每次5 min；滴加正常胎牛血清封闭液37 ℃孵育2 h；擦干组织周围液体，将一抗稀释液稀释的MOGAT2抗体完全覆盖组织，以PBS替代一抗作为阴性对照，4 ℃孵育过夜；复温1 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加HRP标记聚合物，37 ℃ 孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加新鲜配置的DAB显色液显色，显微镜下控制显色时间，充分水洗。苏木素复染，水洗，体积分数1%盐酸酒精分化，水洗；梯度酒精脱水，二甲苯透明，自然干燥后中性树胶封片。
1.5　MOGAT2蛋白表达的判定　以细胞内出现黄色颗粒判定为阳性表达。MOGAT2主要定位于细胞核，采用半定量积分法^［7］判定免疫组织化学染色强弱，计算阳性细胞占总细胞的百分比并给予分值，≤5%为0分，>5%~25%为1分，>25%~50%为2分，>50%~75%为3分，＞75%为4分；根据着色强度给予分值，无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；两个分值相乘，0分为阴性，1~4分为弱阳性，5~8分为阳性，9~12分为强阳性。
1.6　统计学分析　采用Stata 13.0统计学软件对实验数据进行分析。翼状胬肉和正常结膜组织的组间比较采用秩和检验，翼状胬肉组内比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　HE染色　HE染色结果显示，正常结膜组织主要由上皮层和基质层构成，上皮层较薄，上皮细胞排列整齐，基底细胞边界清晰；基质层为疏松结缔组织，见少量成纤维细胞及血管。翼状胬肉表现为肿瘤样组织结构，上皮层明显增生变厚，以头部上皮层细胞层数最多，细胞增大，排列紊乱，部分胬肉上皮的表层由一些圆形细胞和杯状细胞组成，表现出相当高的增殖活性。胬肉上皮下基质层见大量新生的纤维血管组织，伴有大量炎性细胞浸润，纤维嗜碱样变性（图1）。



2.2　免疫组织化学染色
2.2.1　MOGAT2在翼状胬肉和正常结膜组织中的表达　MOGAT2阳性信号主要表达于翼状胬肉及正常结膜组织的上皮细胞层，定位于上皮细胞的细胞核，特别是翼状胬肉的头部，阳性表达更明显，翼状胬肉组织上皮层中的杯状细胞也可见MOGAT2的阳性表达（图2）。54例翼状胬肉组织和18例正常结膜组织中MOGAT2的表达情况见表1。秩和检验比较，两组MOGAT2表达差异有统计学意义（Z=-2.403，P=0.016）。





2.2.2　MOGAT2在翼状胬肉组织中的表达与临床病理分期及各影响因素间的关系　本研究中54例翼状胬肉术前经裂隙灯检查进行临床病理分期，静止期22例，进展期32例。静止期翼状胬肉MOGAT2表达阳性9例，弱阳性6例，阴性7例；进展期MOGAT2表达强阳性8例，阳性20例，弱阳性2例，阴性2例。采用卡方检验进行比较，不同病理分期的翼状胬肉组织中MOGAT2的表达差异有统计学意义（χ²=15.63，P=0.001），提示进展期翼状胬肉MOGAT2的表达增高。分别根据患者的性别、年龄、受教育程度、收入、户外工作时间、户外工作时是否防护、是否吸烟、饮酒、血糖及血压情况、初发或复发等分组，观察MOGAT2在不同指标分组中的表达情况。通过卡方检验对MOGAT2的表达情况进行比较，各组差异均无统计学意义（均为P>0.05；见表2）。
3　讨论
    翼状胬肉是我国常见的眼表疾病之一，目前临床上有效的治疗方式是手术切除，但术后患者有一定的复发率^［8］。对于翼状胬肉的发病机制，国内外有很多研究，但尚未完全明确。翼状胬肉是一种多因素性疾病，国内外对其发病机制有多种假说。首先，新生血管的发生及上皮和成纤维细胞的过度增生是翼状胬肉形成的重要机制之一^{［7，9-11］}，大量病理学研究表明，翼状胬肉组织表现为大量新生血管的发生，弹性纤维、胶原纤维及球结膜上皮细胞的异常增生和变性，新生的组织进一步生长、增厚，形成一种良性肿瘤样组织。国内外相关学者研究结果表明，细胞外基质和角膜缘干细胞屏障的破坏是翼状胬肉发展的基础^［12-15］。角膜缘的基底层上皮细胞是角膜上皮的干细胞，具有维持角膜上皮和结膜上皮之间屏障的作用，一旦角膜缘干细胞遭到破坏，角结膜屏障功能发生障碍，胬肉组织便会迅速侵入角膜组织，破坏组织结构，并向其深部浸润生长。另有研究表明，球结膜组织细胞的大量增殖和凋亡异常的共同作用是翼状胬肉进展的重要原因^［16-17］。翼状胬肉被认为是一种肿瘤样的增生性疾病，由于紫外线、粉尘、风沙等刺激因素的存在而导致某些细胞因子的异常分泌，从而直接或间接引起细胞凋亡受到抑制，上皮细胞异常增殖，促进翼状胬肉的发生和发展^［18］。
    脂质代谢相关蛋白MOGAT2是酰基甘油酰基转移酶家族中的关键成员，是单酰甘油通路中的重要组成部分，参与了甘油三酯的生物合成及甘油酯的代谢，在脂类代谢旺盛的器官如小肠、肝脏、肾脏和胃等器官中都有表达^［19-20］，除此之外，卵黄囊中也有表达，在早期胚胎营养供应中起着重要作用^［21］。MOGAT2参与小肠内吸收膳食脂肪，可能在饮食引起肥胖方面起关键作用^［21-23］。本研究从脂质代谢方面研究翼状胬肉的发病机制，首次报道MOGAT2在翼状胬肉和正常结膜组织中的表达。本研究通过免疫组织化学染色的方法发现MOGAT2主要表达在翼状胬肉和正常结膜组织的上皮细胞的细胞核中，MOGAT2在翼状胬肉组织中表达强度显著高于正常结膜组织，翼状胬肉组织中进展期高于静止期。MOGAT2作为脂质代谢活动的一个关键酶，其表达强度增加提示脂质代谢活性增加。本研究结果表明翼状胬肉组较正常结膜组表现出更高的脂质代谢活性，特别是进展期的翼状胬肉，脂质代谢活性更强，提示脂质代谢活性增加可能参与了翼状胬肉的发生和发展。
    本研究结果显示，MOGAT2的阳性表达主要集中在翼状胬肉组织的上皮层。以往众多研究结果表明，翼状胬肉上皮层细胞表现出很高的增殖活性^{［12，24-26］}，特别是进展期翼状胬肉，细胞的增殖活性更强^［27］。我们推测，翼状胬肉组织中MOGAT2所参与的脂质代谢活性的增加可能和翼状胬肉组织中上皮细胞和杯状细胞的高增殖状态有密切关系，具体的机制还需进一步的实验研究来证实。以往文献表明复发期翼状胬肉增殖更活跃^［28-29］，但是本研究结果中MOGAT2在初发和复发的翼状胬肉组织中的表达差异无统计学意义，这可能是由于本研究收集到的复发病例太少，在今后的研究中，我们将收集更多的病例，进一步完善该结果。Peiretti等^［24］通过原代培养人翼状胬肉和正常结膜组织的成纤维细胞，通过比较两者的脂质新陈代谢表明，人翼状胬肉成纤维细胞表现出较高的脂质代谢活性，他们的研究还进一步表明翼状胬肉成纤维细胞中胆固醇合成和代谢的改变可能与细胞增殖有关^［24］，该研究从体外研究角度支持了本研究结果。
    综上所述，MOGAT2与翼状胬肉的发生和发展有密切关系，从脂质代谢方面研究翼状胬肉可能的发病机制，这一结果将为翼状胬肉的临床预防和治疗提供新的依据和新的思路。