《眼科新进展》  2018年2期 131-135   出版日期：2018-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
PFKFB3、S1P2在2型糖尿病大鼠视网膜中的表达及tBHQ的干预作用


    糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的发病机制尚未完全明了。Selva等［1］的研究表明，高糖对细胞的损伤是通过直接刺激糖酵解途径实现的，而6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-bisphosphatase-3，PFKFB3）是糖酵解途径的一种关键调节器，可促进糖酵解的发生，糖酵解产生大量乳酸，而乳酸的堆积可刺激血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达增加。PFKFB3可促进血管的新生，在敲除PFKFB3基因的新生小鼠模型中，视网膜的新生血管数、血管分支数均降低［2］；1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）是一种具有生物活性的脂质信使，可由鞘氨醇激酶（sphingosine kinases，Sphk）催化产生，在高糖环境下，S1P生成增加，S1P作用于1-磷酸鞘氨醇受体2（sphingosine-1-phosphate receptor 2，S1P2），激活细胞内信号通路，在细胞增殖、炎症调节、血管形成等过程中起着重要作用［3］。同时有研究发现［4］，VEGF的升高可以促进Sphk的表达。既往本课题组研究发现［5］，叔丁基对苯二酚（tertiary butylhydroquinone，tBHQ）可以减少糖尿病（diabetes mellitus，DM）大鼠视网膜中VEGF表达。因此，本研究通过检测2型DM大鼠视网膜中PFKFB3、S1P2、VEGF的表达情况，了解PFKFB3、S1P2在2型DM大鼠视网膜中的作用，为研究DR的发病机制提供依据。并同时研究在使用tBHQ干预剂后，2型DM大鼠视网膜中PFKFB3、S1P2、VEGF的变化，了解tBHQ对 PFKFB3、S1P2的作用。
1　材料与方法
1.1　材料　链脲佐菌素（美国Sigma公司）；tBHQ（美国 Acros公司）；兔抗大鼠PFKFB3、S1P2、VEGF多克隆抗体（美国 Bioworld公司）；血糖仪（德国罗氏公司）；OLYMPUS BX53数字显微镜及Image-Pro Plus图像分析软件；PFKFB3、S1P2、VEGF、GAPDH引物序列（上海生工生物工程有限公司）；提取总RNA试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应（PCR）试剂盒、SYBR Green工染料（日本宝生物工程有限公司）；实时荧光定量PCR 仪CFX96（美国BIO-RAD公司）；Leica生物显微镜（德国Leiea公司）。
1.2　方法
1.2.1　动物分组与模型制备　雄性Sprague Dawley大鼠60只，4周龄，体质量180～200 g，由西南医科大学动物实验中心提供。适应性喂养7 d后按数字表法随机抽取12只大鼠为正常组（NC组），其余48只大鼠为造模组。NC组大鼠给予基础饲料喂养；造模组大鼠给予高脂高糖饲料喂养。1个月后，造模组大鼠腹腔快速注射30 mg·kg-1链脲佐菌素制作2型DM模型；7 d后经尾静脉采血检测空腹血糖>16.7 mmol·L-1者视为造模成功。NC组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。造模组剔除血糖恢复鼠6只，随机分为DM组、tBHQ组，均为21 只大鼠。造模成功后7 d，tBHQ组大鼠给予添加10 g·L-1tBHQ的高脂高糖饲料喂养；NC组、DM组大鼠饲养方法不变，喂养4周和12周。剔除饲养过程中死亡大鼠，最终NC组、 DM组、tBHQ组分别有12只、20只、20只大鼠纳入研究。实验动物的使用遵循国家科学技术委员会1988年颁布的《实验动物管理条例》。
1.2.2　大鼠眼球标本的制备　将NC组、 DM组、tBHQ组大鼠于tBHQ干预治疗4周、12周时空腹过夜，采用20 g·L-1戊巴比妥钠50 mg·kg-1腹腔内注射行全身麻醉，以穿刺法收集大鼠心脏血液备用，随即摘取双眼眼球。制作眼球标本，先用19 G穿刺刀于角膜缘处穿刺前房后固定，其他组织置于 40 g·L-1 多聚甲醛溶液中固定24 h以上；常规石蜡包埋，连续切片，切片厚度分别为2 μm和5 μm。各时间点使用剩余眼球迅速沿锯齿缘环形剪除眼前节，将视网膜剥离并在PBS中漂洗，清除残存的玻璃体，最后将视网膜置于去RNA酶的1.5 mL EP管中，迅速置于液氮中并于-80 ℃保存备用。
1.2.3　各组大鼠DM相关生化指标的检测　收集大鼠心脏全血，采用7180全自动生化分析仪（日本日立公司）测定大鼠血清空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）。采用125I胰岛素放射免疫分析盒检测大鼠空腹血清胰岛素（fasting serum insulin，FINs）含量。
1.2.4　免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜中PFKFB3、S1P2、VEGF蛋白的表达量　取大鼠眼球2 μm石蜡切片，行常规苏木精-伊红染色，中性树胶封片后于光学显微镜下观察视网膜结构。取大鼠眼球5 μm石蜡切片，石蜡切片常规脱蜡入水，PBS漂洗6 min，0.1 mmol·L-1枸橼酸盐缓冲液预热至 92~98 ℃，放入载玻片，微波炉内92~98 ℃加热5 min，自然冷却至室温进行抗原修复，分别滴加兔抗大鼠PFKFB3（1∶100）、S1P2（1∶100）、VEGF（1∶100）一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤；加二抗（1∶200）室温孵育40 min，DAB显色，用OLYMPUS BX53数字显微镜及Image-Pro Plus图像分析软件分析PFKFB3、S1P2、VEGF在大鼠视网膜中的表达分布。每组切片任意抽取6张，每张切片选择5处不同视野于光学显微镜下观察，棕黄色或棕褐色着色者为阳性反应细胞，测定单位面积的平均吸光度（A）值，实验重复3次，取平均值。
1.2.5　qRT-PCR法检测大鼠视网膜中PFKFB3、S1P2、VEGF mRNA的表达　PFKFB3、S1P2、VEGF引物分别为153 bp、299 bp、182 bp。三组大鼠分别于干预4周、12周时各取6份视网膜机械匀浆后，用总RNA提取试剂盒提取视网膜总RNA，测得RNA的A260/A280为1.9~2.2，参照逆转录试剂盒说明书以RNA为模板逆转录合成cDNA，反应体系为10 μL；反应条件：37 ℃15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR；CFX96 real-time PCR Detetion System）对cDNA进行PCR扩增，总反应体系为25 μL；扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火及延伸30 s；共39个循环。以相同的反应体系同时进行内参GAPDH的荧光定量检测。结果使用比较Ct值法分析。
1.2.6　TUNEL法检测各组大鼠视网膜神经节细胞的凋亡指数　石蜡包埋组织，切片脱蜡后，用含体积分数2%H2O2的PBS于室温下反应5 min，PBS浸洗5 min，滴加54 μL末端核酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyl ransferase，TdT）缓冲液，室温放置1～5 min，于湿盒中37 ℃孵育1 h，滴加54 μL过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中37 ℃孵育30 min。SABC法染色，DAB显色，蒸馏水冲洗5 min×4次，苏木素复染，脱水，透明后封片。阴性对照不加TdT酶，其余步骤相同。在光学显微镜下，细胞核或细胞质被染成棕黄色或棕褐色为凋亡细胞，以细胞凋亡指数作为评价指标，每组切片任意抽取6张，在高倍镜下（400×）每张切片随机拍摄3～5个视野，计算视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）凋亡细胞数占细胞总数的比例。凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。
1.3　统计学方法　采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。本研究中检测指标的数据资料经W检验呈正态分布，以x?±s表示，组间均数经Levene检验方差齐，方差不齐的组间比较采用矫正t检验。采用均衡分组两因素干预多水平分组实验设计，各组大鼠干预不同时间的检测指标总体差异比较采用两因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　各组大鼠DM相关生化指标的改变　三组大鼠间干预治疗4周、12周时FPG水平明显不同，总体比较差异均有统计学意义（均为P=0.000），其中与NC组比较，DM组及tBHQ组大鼠FPG水平均明显升高，且DM组12周高于4周，而tBHQ组12周明显低于4周，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。三组大鼠在干预治疗后不同时间FINs总体比较差异亦均有统计学意义（均为P=0.000），其中DM组及tBHQ组均明显高于NC组（均为P<0.05）；4周时DM组与tBHQ组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）；12周时tBHQ组较DM组升高，差异有统计学意义（P<0.05）；DM组12周与4周时比较差异无统计学意义（P>0.05）；tBHQ组12周时明显高于4周，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。



2.2　各组大鼠视网膜中PFKFB3、S1P2、VEGF蛋白的相对表达量　4周和12周时各组中均可见PFKFB3、S1P2、VEGF蛋白的阳性表达，且主要分布于RGC层、内核层（inner nuclear layer，INL）。
    各组大鼠在干预治疗不同时间点视网膜中PFKFB3、S1P2、VEGF蛋白相对表达量的总体比较差异均有统计学意义（FPFKFB3分组=264.43 、FPFKFB3时间=4.19；FS1P2分组=547.87、FS1P2时间=58.00；FVEGF分组=2181.39、FVEGF时间=30.52；均为P<0.05）。
    4周、12周时，DM组PFKFB3（t=14.00、17.80）、S1P2（t=19.00、32.00）、VEGF（t=44.12、44.12）蛋白的表达均较NC组增加，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；tBHQ组PFKFB3（t=2.60、10.20）、S1P2（t=7.50、24.50）、VEGF（t=44.12、44.12）蛋白的表达均较DM组降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与4周相比较，12周时DM组PFKFB3（t=5.00）、S1P2（t=15.00）、VEGF（t=8.23）蛋白的表达均较增加，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；tBHQ组S1P2（t=2.50）蛋白的表达较4周时降低，差异有统计学意义（P<0.05），PFKFB3、VEGF的表达与4周时相比，差异均无统计学意义（均为P>0.05），见表2。




2.3　各组大鼠视网膜中PFKFB3、S1P2、VEGF mRNA的相对表达量　qRT-PCR检测结果显示，各组大鼠在干预治疗后不同时间点视网膜中PFKFB3、S1P2、VEGF mRNA相对表达量的总体比较差异均有统计学意义（FPFKFB3分组=30.97、FPFKFB3时间=4.61；FS1P2分组=53.27、FS1P2时间=0.27；FVEGF分组=105.03、FVEGF时间=17.90；均为P<0.05）。
    4周和12周时，DM组PFKFB3（t=3.59、6.36）、S1P2（t=5.36、8.50）、VEGF（t=6.48、12.68）mRNA均较NC组增多，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；tBHQ组PFKFB3（t= 2.38、6.85）、S1P2（t=2.17、8.69）、VEGF（t=2.506、13.38）mRNA均较DM组减少，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；12周时，DM组PFKFB3（t= 3.65）、S1P2（t= 3.52）、VEGF（t=8.13）mRNA均高于4周时，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；tBHQ组S1P2（t=3.00）、VEGF（t=2.74）mRNA均低于4周时，差异均有统计学意义（均为P<0.05），见表3。
2.4　各组大鼠RGC的凋亡指数　TUNEL法检测结果显示，各组大鼠在干预治疗后不同时间点RGC凋亡指数的总体比较差异均具有统计学意义（F分组=56.29、F时间=2.00；均为P<0.05）。4周和12周时，DM组（t=7.54、7.21）较NC组增多，tBHQ组（t=2.43、7.36）较DM组减少，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；12周时，DM组（t=2.36）高于4周，tBHQ组（t=2.57）低于4周，差异均有统计学意义（均为P<0.05），见表4。



3　讨论
    机体高糖和缺氧引起糖酵解过程增强。PFKFB3是糖酵解途径的一种关键调节器。且PFKFB3是近年来发现的参与细胞代谢的新型激酶之一，它对细胞的生长和增殖具有重要的调节作用［6］。研究发现PFKFB3在肝癌、肺癌、肾癌等实体肿瘤中明显高表达［7］。在高氧诱导的视网膜病变小鼠模型中，视网膜存在大量新生血管，当给予腹腔注射PFKFB3抑制剂后，视网膜中新生血管明显减少，说明PFKFB3可以促进血管的新生［8］。本研究发现，在2型DM大鼠视网膜中PFKFB3有表达，主要表达于视网膜RGC层和INL，且DM组较NC组增多。说明PFKFB3参与了DM大鼠视网膜的病理过程，并在高糖环境下产生了一定作用。
    S1P是细胞膜组成成分磷脂的代谢产物，目前发现人类细胞的细胞膜上存在五种与S1P特异性结合的G蛋白偶联受体，分别为S1P1~S1P5。激活不同的细胞内信号途径而产生广泛的生物学效应，包括细胞增殖、血管形成等［9-10］。内皮细胞表面主要存在S1P1~S1P3受体的表达，S1P作用于S1P2受体，促进血管通透性增加［11］。本研究发现，在2型DM大鼠视网膜中S1P2有表达，主要表达于视网膜RGC层及INL，且DM组较正常组增多。说明S1P2参与了DM大鼠视网膜的病理过程，并在高糖环境下产生了一定作用。
    S1P可由SphK催化产生，SphK/S1P信号通路被许多研究者视为一条有关细胞存亡、增殖的信号途径，在血管形成过程中起重要作用。有研究表明，VEGF可激活SphK/S1P信号通路，诱导S1P的生成，作用于S1P2后调节血管的形成，在促进血管新生及调节血管通透性方面有重要作用［12］。在新生小鼠视网膜血管内皮细胞的研究中发现，PFKFB3基因敲除可阻止新生血管出芽、分支和生长［13］。有研究表明，PFKFB3可以通过糖酵解途径促进VEGF表达增加［14-15］。这些研究表明，PFKFB3通过激活糖酵解途径，促进VEGF表达增加。而VEGF表达增加后可激活SphK/S1P信号通路，促进鞘氨醇转化为S1P，作用于S1P2后，促进血管的形成。本研究发现，PFKFB3、VEGF及S1P2的改变是同步的，在DM组中，PFKFB3、VEGF及S1P2在视网膜中的表达均较NC组升高，且均表达于RGC层及INL，再次说明，PFKFB3、S1P2及VEGF共同参与DM大鼠视网膜的病理过程，与DR的发生密切相关，其可能是通过PFKFB3/VEGF/S1P2信号途径起作用。
    本研究中DM大鼠使用tBHQ干预剂后，干预治疗12周时的FINs较4周增加，且大鼠12周时的FPG较4周降低，说明tBHQ对DM大鼠胰岛功能具有一定的保护作用；而4周时tBHQ组较DM组FINs水平降低，并未升高，说明在使用tBHQ干预4周时tBHQ可能还未对胰岛素起到保护作用，但因此时DM组与tBHQ组之间差异无统计学意义，因此该结果还有待进一步研究。本课题组既往研究发现［5］，tBHQ可促进DM大鼠视网膜组织中Bcl-2的表达，降低VEGF的表达，对视网膜组织有减少细胞凋亡、抑制视网膜血管增殖等作用。而本研究发现，tBHQ作用后DM大鼠视网膜中PFKFB3、S1P2及VEGF的表达降低，说明使用tBHQ干预剂降低VEGF表达的同时可降低PFKFB3、S1P2的表达，对DM大鼠视网膜有一定的保护作用，但其作用机制有待进一步研究。
    同时，本研究通过检测大鼠RGC的凋亡发现，DM组中凋亡指数较NC组增多，说明DM大鼠RGC的凋亡增加，同时PFKFB、S1P2的表达增加与细胞凋亡可能相关；使用tBHQ干预剂后，DM大鼠RGC的凋亡指数降低，说明tBHQ干预剂可以抑制大鼠RGC的凋亡，同时使用tBHQ干预后PFKFB3、S1P2的表达降低，进一步说明DM大鼠视网膜RGC的凋亡可能与PFKFB3、S1P2的表达相关。
    综上所述，2型DM大鼠视网膜中PFKFB3、S1P2及VEGF呈高表达，主要表达于RGC层及INL，说明PFKFB3、S1P2及VEGF参与2型DM大鼠视网膜的病理过程，与DR的发生密切相关，其可能是通过PFKFB3/VEGF/S1P2信号途径起作用。同时PFKFB3、S1P2的表达可能与视网膜RGC的凋亡相关。本研究还发现tBHQ干预剂降低VEGF表达的同时可降低PFKFB3、S1P2的表达，减少RGC的凋亡，对DM大鼠视网膜有一定的保护作用，但其作用机制有待于进一步研究。