《眼科新进展》  2018年2期 126-130   出版日期：2018-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
色素上皮衍生因子基因修饰的脐带间充质干细胞对糖尿病大鼠视网膜组织病理改变的影响


    糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常见的并发症，也是糖尿病致盲的主要原因［1］。目前研究表明DR不仅是微血管病变，而且视网膜神经细胞亦发生了性状及功能的改变［2］。因此，从临床意义出发，对DR的防治重点不仅是治疗视网膜血管病变，而且还应同时治疗其神经性改变。间充质干细胞具有自我更新和多种分化的能力，可促进组织再生，为DR的治疗提供新的思路［3］。色素上皮衍生因子（pigment epithelial-derived factor，PEDF）是一种天然的新生血管抑制剂，还是一种重要的神经营养和神经保护因子，对糖尿病血管病变及神经病变均具有保护作用。为此，本研究通过玻璃体内注射转染PEDF基因修饰的人脐带间充质干细胞（pigment epithelial-derived factor gene-modified human umbilical cord mesenchymal stem cells，PEDF-MSCs）后，观察其对糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用，为临床DR的早期治疗提供一种新的途径及一定的理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料　收集潍坊医学院附属医院产科健康新生儿产后4 h内新鲜脐带，已征得患者及家属同意，并签署知情同意书。DMEM/F12培养基（美国Hyclone公司），胎牛血清（四季青公司），CD34、CD45、CD73、CD105、CD90、HLA-DR（北京泰泽瑞达有限公司），慢病毒载体（吉凯基因有限公司），活细胞示踪剂cm-dil（上海翊圣生物公司），STZ（北京索莱宝科技有限公司），HE染色试剂盒（北京蓝博斯特生物有限公司），免疫荧光显微镜（Olympus，日本）。
1.2　人脐带间充质干细胞的体外培养、鉴定及其标记与转染　将人脐带用组织块法分离培养出人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs），原代融合达80%后进行传代培养，采用流式细胞学方法进行免疫表型鉴定。均表达 CD105、CD73 和 CD90，阳性率不低于95%，不表达CD34、CD45、CD11b、CD19和 HLA-DR，阳性率不高于2%。取第4代hUCMSCs用cm-dil进行荧光标记。将2瓶细胞用PBS重悬，加入1 g·L-1 cm-dil 5 μL（50 μL DMSO溶解50 μg cm-dil），37 ℃细胞培养箱放置6 min，4 ℃冰箱放置15 min，PBS清洗2次，加入细胞培养液放入培养瓶中于荧光显微镜下观察其状态，然后继续培养。另取2瓶第4代细胞通过LV-PEDF载体进行转染。将2瓶细胞以每毫升（30~50）×103个目的细胞接种在两个6孔板中贴壁一晚，使用完全培养基稀释聚凝胺至浓度为50 mg·L-1，标记为聚凝胺（M），使用感染增强稀释液来稀释聚凝胺至浓度50 μg·mL-1，标记为聚凝胺（E），以感染复数为50用慢病毒感染细胞，病毒滴度为100×109 U·L-1，各板孔加入2 mL聚凝胺（M）、聚凝胺（E），最后加入培养液混匀继续培养，10 h后观察细胞状态，并更换新鲜培养液。96 h后荧光显微镜下观察荧光表达情况。
1.3　DR大鼠模型建立及干预治疗　将32只健康SD大鼠随机分为正常对照组（N组）、实验对照组糖尿病注射PBS组（D1组）、糖尿病注射hUCMSCs治疗组（D2组）、糖尿病注射PEDF-MSCs治疗组（D3组），每组各8只大鼠。D1、D2、D3组18只大鼠测空腹血糖为（4.6±0.78）mmol·L-1，禁食12 h后按照60 mg·kg-1腹腔注射STZ。腹腔注射后72 h测空腹血糖，共有17只大鼠尾静脉血糖浓度大于16.7 mmol·L-1，认为模型建立成功。未成功大鼠再次补充注射STZ后72 h测血糖为22 mmol·L-1，也认为造模成功。之后每周测量24只高血糖大鼠的血糖1次，以判断是否为持续高血糖。D1、D2、D3组大鼠在建模后3个月，右眼玻璃体内分别注射PBS、hUCMSCs、PEDF-MSCs各5 μL。hUCMSCs及PEDF-MSCs细胞密度均为20×106 mL-1。玻璃体内注射2周后，用免疫荧光显微镜观察各组移植细胞在玻璃体内中的表达情况。将大鼠玻璃体取出放入96孔板中，观察其荧光表达情况。
1.4　视网膜病理改变的检测　玻璃体内注射干预治疗2周后，随机取各组6只大鼠过量麻醉处死，摘除右眼球放在40 g·L-1多聚甲醛中固定 24 h，眼球侧面圆形切口，取出晶状体，梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切成4 μm厚切片。用组织病理学观察视网膜形态变化。每组操作均按购买染色试剂盒说明书的要求进行。在400倍物镜放大下，用图像分析系统采集数码图像。应用Image-Pro Plus6.0专业图像分析软件系统进行测定，求取各组视网膜厚度的平均值。测量范围在距离视盘中心约1 mm范围内。
1.5　统计学分析　本研究采用SPSS 16.0进行统计分析，各组数据用均数±标准差进行统计学描述。各组数据呈近似正态分部，因此两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　荧光显微镜观察荧光标记下的hUCMSCs　hUCMSCs用cm-dil荧光标记后可见细胞呈椭圆形分散状态漂浮在培养基中，荧光呈红色（图1）；转染96 h后显微镜下观察可见细胞已贴壁，簇状排列，呈绿色荧光（图2）。




2.2　荧光显微镜观察PEDF-MSCs在大鼠眼内表达　玻璃体内注射2周后，荧光显微镜下观察到D2组糖尿病大鼠玻璃体内有簇状排列的红色荧光（图3），视网膜中并未观察到明显的红色荧光。D3组糖尿病大鼠玻璃体内可见簇状排列的红色荧光，弥漫性分布于玻璃体中（图4），但视网膜中并未观察到明显的绿色荧光，表明hUCMSCs和PEDF-MSCs可较长时间在眼内存活且持续表达。
2.3　HE染色观察视网膜结构　N组大鼠视网膜各层结构完整，层次清晰，细胞排列整齐，染色均匀；D1组大鼠视网膜神经纤维层（nerve fiber layer，NFL）出现明显水肿，血管扩张，内丛状层（inner plexiform layer，IPL）结构疏松，内核层（inner nuclear layer，INL）细胞排列紊乱；D2组可见NFL较D1组水肿减轻，IPL结构稍疏松，INL及外核层（outer nuclear layer，ONL）细胞排列不紧密；D3组NFL 水肿较D1、D2组进一步减轻，INL与ONL细胞排列规整，未见血管扩张（图5）。
2.4　各组视网膜总厚度测量结果　N组视网膜厚度为（103.82±4.15）μm，D1组为（138.86±4.71）μm，D2组为（131.17±3.89）μm，D3组为（112.24±4.22）μm。N组与D1组、D2组及D3组间差异均有统计学意义（t=13.67，P＜0.05；t=11.77，P＜0.05；t=3.48，P＜0.05）；D1组与D2组及D3组间差异有统计学意义（t=3.08，P＜0.05；t=10.31，P＜0.05）；D2组与D3组间差异有统计学意义（t=8.07，P＜0.05）。





3　讨论
    hUCMSCs 是一种从人脐带获取的成体干细胞，具有多向分化潜能，且目前还未有其诱导肿瘤形成的相关报道［4-5］，其异构性低，弱免疫原性，资源丰富，获取方法容易，不存在伦理道德问题［6-7］。基于以上优势，本研究中选取了hUCMSCs作为实验对象。有研究表明，hUCMSCs分泌的各种细胞因子能够抑制细胞的凋亡，并促进损伤神经的修复及加强其稳定性［8］。Scalinci等［9］将hUCMSCs注入鼠玻璃体内后，检测发现玻璃体内及视网膜中多种神经营养因子的含量升高，因此，hUCMSCs能够分泌神经营养因子，营养受损的视网膜。PEDF是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的一员，是目前发现存在于眼内具有多种生物活性的蛋白因子，通过其抗氧化特性作用于视网膜周细胞及血管内皮细胞，发挥其降低血管通透性及减少新生血管形成的作用［10-11］。PEDF可上调视网膜Müller细胞谷氨酰胺合成酶的表达，改善谷氨酸转运体的功能，从而改善谷氨酸循环抑制神经细胞的凋亡［12-14］。外源给予PEDF可显著减少高糖刺激引起的视网膜Müller细胞的凋亡及细胞损伤，具有显著的保护作用［15］。本实验中将外源性PEDF基因转染入hUCMSCs，将PEDF-MSCs 采用玻璃体内注射的方式移植入糖尿病大鼠体内，观察其对糖尿病大鼠视网膜损伤的改善作用。
    玻璃体内分别注射hUCMSCs与PEDF-MSCs后2周，荧光显微镜下分别观察到玻璃体内红色（D2组）、绿色荧光（D3组），表明细胞能够较长时间存活于玻璃体，然而视网膜内并未观察到明显的荧光。在Park等［16］的研究中将骨髓MSCs注射至视网膜下，可在视网膜内观察到干细胞，而玻璃体内注射骨髓MSCs后并未在视网膜上观察到干细胞，仅聚集在玻璃体内中，与本实验结果类似，推测可能与给药途径有关。本研究中N组大鼠视网膜NFL出现明显水肿，血管扩张，IPL结构疏松，INL细胞排列紊乱，表明糖尿病早期阶段即可引起视网膜血管与神经的损伤。用hUCMSCs与PEDF-MSCs进行玻璃体内注射干预治疗2周后，结果显示hUCMSCs干预治疗后，NFL水肿减轻；而注射PEDF-MSCs之后，视网膜结构破坏明显减轻，NFL水肿明显减轻，INL与ONL层细胞排列规整。以上结果提示没有转染PEDF基因的hUCMSCs本身对视网膜也有一定的保护性作用，而转染后的PEDF-MSCs对视网膜损伤的改善程度优于hUCMSCs。推测其原因除细胞本身具有抑制细胞凋亡及促进神经损伤修复的作用外，PEDF则加强了抑制神经细胞凋亡的作用，并能进一步减少和修复细胞损伤。
    由于客观条件限制，本实验未能进行不同浓度梯度的玻璃体内注射PEDF-MSCs及视网膜下腔注射的对照实验研究，故其最佳用药剂量和用药途径尚需进一步研究；并且本研究中未多个时间点观察其作用效果，因此PEDF-MSCs在玻璃体腔内的半衰期尚未明确。另外，PEDF-MSCs治疗DR后的远期效果还需进一步研究。