《眼科新进展》  2018年2期 121-125   出版日期：2018-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
星形胶质细胞活化基因-1（AEG-1）在葡萄膜黑色素瘤中的表达及其与临床组织病理学的关系


    葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UM）是成人最常见的眼内原发性恶性肿瘤，每年一百万人中近6人罹患此疾病［1］，其中脉络膜黑色素瘤和睫状体黑色素瘤所占比例分别为92%~94%和6%~7.8%［2］。UM组织病理学与患者预后之间相关性研究成果已成为UM患者临床检测的重要手段及指标。近几年研究发现一系列癌基因与肿瘤的发生发展有着显著相关性，其中星形胶质细胞活化基因-1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）是目前研究较热的一个原癌基因，AEG-1表达的蛋白又称异黏蛋白（metadherin，MTDH），其过表达已被证实与多种恶性肿瘤的发生发展有显著相关性，但AEG-1在UM中的表达尚未见相关的研究［3］。本研究通过免疫组织化学法检测AEG-1在UM组织中的表达，并分析其表达与临床组织病理学高危因素的关系，初步探讨AEG-1表达与 UM侵袭转移的相关性，以期为UM临床相关理论治疗及其预后提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　组织病理学标本　收集2013年1月至2017年5月北京同仁医院眼科病理室存档的50例（50眼）UM石蜡组织标本（实验组），11例（11眼）因外伤行眼球摘除术但大部分葡萄膜组织正常的石蜡组织标本（对照组）。UM石蜡标本中，男25例（25眼），女25例（25眼）；右眼26例，左眼24例；患者年龄28～79（47.6±14.9）岁。伴视盘受累者33例（33眼），继发视网膜脱离者41例（41眼），累及睫状体者26例（26眼），伴虹膜新生血管者23例（23眼）；肿瘤最大直径范围为3～23 mm，其中>16 mm者21例（21眼）；肿瘤高度范围为1～14 mm，其中>8 mm者17例（17眼）；上皮样细胞型9例（9眼），混合细胞型18例（18眼），上皮样或混合细胞型27例（27眼）；发生肿瘤侵犯巩膜导管者47例（47眼）；肿瘤眼外生长患者36例（36眼）。所有病例术前均未接受化学治疗或放射治疗等辅助治疗。眼球标本均经过100 g·L-1多聚甲醛固定，并常规石蜡包埋。
1.1.2　主要试剂和仪器　兔抗人MTDH多克隆抗体（ab45338，美国Abeam公司）；免疫组织化学ElivisionⅢSuper试剂盒（KIT-9922，中国福州迈新生物技术开发公司）；AEC显色试剂盒（AEC-0037，中国泰科兰博北京生物技术有限公司）；PBS缓冲液、枸橼酸盐缓冲液（MVS-0066，中国福州迈新生物技术开发公司）。
1.2　方法
1.2.1　免疫组织化学检测AEG-1表达　各组眼蜡块组织连续切片5张（厚3.0~3.5 μm），其中1张经过苏木精-伊红染色进行病理诊断和分类，3张经免疫组织化学染色，1张以PBS代替一抗染色予以对照。石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱蜡水化，PBS漂洗3次，每次3 min。加入pH 9.0的Tris/EDTA抗原修复液进行微波抗原修复，滴加体积分数3%H2O2阻断溶液，室温条件下孵育15 min以阻断其内源性过氧化物酶的活性；吸去H2O2，PBS漂洗3次，加入兔抗人MTDH（AEG-1）多克隆抗体一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次3 min；以HRP标记即用型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，室温孵育60 min，PBS漂洗3次，每次3 min；每张切片滴加新鲜配制的AEC溶液，在光学显微镜下控制显色；苏木素复染5 min，盐酸分化3 s，PBS漂洗3次，水性封片剂封片。其中PBS代替一抗作为阴性对照。
1.2.2　免疫组织化学染色结果判定　所有患眼均经2 名以上病理科专家在不知临床资料的前提下进行分析确定。AEG-1表达产物主要定位于细胞核周、细胞浆和细胞膜，根据染色细胞百分率及染色程度进行评定［4］，（1）染色细胞所占计数细胞的百分比：每张组织切片随机选取5个高倍镜视野，按照阳性细胞数占同类细胞数的百分比情况评分，≤5％记0分，>5％～25％记1分，>25％～50％记2分，>50％记3分。（2）染色程度评分：无着色记0分，浅着色记1分，中度着色为2分，深着色为3分。将每张组织切片染色程度评分与染色细胞百分比得分相乘的积为染色结果最后得分，其中0～1分记为阴性（-），2～3分记为弱阳性（±），4～6分记为中等阳性（+），>6分记为强阳性（++）。为了简化数据处理，将阴性（-）与弱阳性（±）合并为阴性；中等阳性（+）与强阳性（++）合并为阳性。
1.3　统计学分析　采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。在实验组和对照组AEG-1的表达用频数和率表示。采用Pearson χ2检验和Fisher确切概率法比较实验组和对照组的组间及UM不同临床组织病理学特征分类组中AEG-1表达的差异。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2　结果
2.1　AEG-1在UM和正常葡萄膜组织标本中的表达　AEG-1蛋白染色物质呈准确的粉红色或者红色颗粒，主要位于UM细胞核周、细胞浆和细胞膜。免疫组织化学染色结果显示，实验组50例（50眼）UM组织标本中，AEG-1阴性表达21眼（42.0%），阳性表达29眼（58.0%）；对照组11例（11眼）正常葡萄膜组织标本中AEG-1均呈阴性表达，两组AEG-1表达比较差异有显著统计学意义（χ2=12.162，P=0.000），提示AEG-1在UM中高表达（图1）。



2.2　AEG-1表达与UM一般临床病理特征的关系　UM患眼临床病理特征中，不同性别（P=1.000）、眼别（P=1.000）、年龄间（P=0.398），累及视盘与否（P=1.000），继发视网膜脱离与否（P=1.000），AEG-1的表达差异均无统计学意义，见表1。



2.3　AEG-1表达与UM临床病理学高危因素的关系　实验组中，各高危因素组AEG-1阳性表达情况见表2，各特征组除肿瘤细胞为上皮样细胞型及肿瘤侵犯巩膜导管外，AEG-1表达比较差异均有统计学意义（均为P<0.05），提示UM组织中AEG-1的表达差异与患者肿瘤累及睫状体，虹膜新生血管生成，肿瘤基底最大直径>16 mm，肿瘤高度>8 mm，细胞类型为混合细胞型、上皮样或混合细胞型，眼外生长其均有显著相关性（表2，图2~图5）。







3　讨论
    UM是成人最常见的眼内原发性肿瘤，恶性程度高且预后差［5-6］，基于转移风险的不确定性，需要对更多的预后相关因素作进一步研究［7］。Kang等［8］于2002年鉴定发现AEG-1。有研究认为AEG-1可作为一种广泛肿瘤生物标记物，在神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤中均存在AEG-1高表达［9］。本研究通过对AEG-1在UM中的表达及其与临床组织病理学特征相关性研究显示AEG-1表达与UM的预后具有相关性。本研究通过AEG-1表达与一般临床病理特征的相关性分析，得出不同年龄、性别、眼别、是否视盘受累、是否继发视网膜脱离及是否侵犯巩膜导管组AEG-1的表达差异均无统计学意义（均为P>0.05），但其他相关大样本的研究认为患者预后与高龄、视盘受累，巩膜导管也存在相关性［10］，这与本研究结果不一致，可能是样本量较少所致［11］。
    本研究显示AEG-1在UM中呈高表达。有研究依据肿瘤最大基底直径将UM分为小肿瘤（≤10 mm）、中肿瘤（>10～16 mm）、大肿瘤三个等级（>16 mm）［12］，随着肿瘤增大其生存率逐渐下降［13-14］，所以最大基底直径可以作为预测UM患者预后相关因素之一。本实验中将小肿瘤及中肿瘤的最大基底直径合并，分析肿瘤最大基底直径>16 mm与≤16 mm两组间AEG-1表达的差异，结果显示，差异具有统计学意义（P=0.000），说明肿瘤基底最大直径越大，AEG-1阳性表达越明显，提示患者预后越差。同样关于肿瘤大小的参数中，肿瘤高度>8 mm其5 a转移率较肿瘤高度≤8 mm高，所以瘤体高度也被认为是评估UM患者预后的关键因素［15］。本研究分析肿瘤高度>8 mm 与≤ 8 mm两组间AEG-1表达的差异性，两组比较差异具有统计学意义（P=0.016），考虑AEG-1阳性表达率随肿瘤高度的增大而升高，同时UM转移风险率也随之增大。
    当UM累及或原发于睫状体时，因肿瘤位于眼前节，与房水流出道相邻，加之多数肿瘤患者有虹膜新生血管的生成，UM的转移风险也会明显增高［16］。本实验通过对UM累及睫状体与否和虹膜新生血管生成与否与AEG-1表达的相关性分析显示，两特征组内比较差异均具有统计学意义（P=0.044、0.047），说明AEG-1的高表达与UM累及睫状体和虹膜新生血管生成密切相关，提示AEG-1的高表达与UM转移有关。
    根据病理细胞形态，将UM分为4种细胞类型，分别为梭形细胞型、上皮样细胞型、混合细胞型、其他类型（包括簇状型、坏死型或气球样细胞型等）。有研究发现梭形细胞型预后较好，上皮样细胞型预后最差，混合细胞型预后取决于上皮样细胞与梭形细胞的比例［17］。本研究显示AEG-1表达与UM细胞类型为混合细胞型具有显著相关性（P=0.008），并且当混合细胞型中上皮样细胞占比例较大时，AEG-1阳性表达率明显升高，但UM细胞类型仅为上皮样细胞型时，其与AEG-1表达无相关性（P=1.000），其原因可能是UM上皮样细胞型患眼样本量较少（5眼），且对比样本多为混合细胞型。为了提高多种细胞类型与AEG-1表达相关性的准确性，研究合并分析上皮样型或混合型类型，得出当UM细胞为上皮样型或混合型时，其AEG-1阳性表达率为74.1%，差异具有统计学意义（P=0.021），表明上皮样或混合细胞型与AEG-1具有相关性。基于上述统计结果，理论上认为AEG-1的高表达与上皮样或混合细胞类型有相关性，提示患者预后差［17］。
    球外生长也被认为是肿瘤转移的独立预后因素，当肿瘤球外生长时，更容易通过血管、淋巴管或直接蔓延等途径增加转移的风险［18］。本研究同样分析了球外生长与否与AEG-1表达的相关性，发现球外生长与AEG-1表达显著相关，差异具有统计学意义（P=0.012），考虑AEG-1的高表达与肿瘤球外生长具有相关性。
    综上所述，在UM中AEG-1的表达与肿瘤侵犯睫状体、虹膜新生血管生成、基底直径>16 mm、肿瘤高度>8 mm、细胞形态为上皮样细胞型或混合细胞型及肿瘤球外生长均有显著相关性，提示转移风险高，预后差。但对于其机制的研究，AEG-1是否通过改变UM细胞生物学行为、调节侵袭转移相关的信号传导通路以及相关基因的表达水平对UM侵袭转移的影响尚需要分子生物学实验来进一步研究证明。