《眼科新进展》  2018年2期 111-115   出版日期:2018-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
年龄相关性白内障患者miR-138的表达及其对人晶状体上皮细胞凋亡的影响


    沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,参与细胞凋亡的调节并与细胞应激状态下的存活有关[1]。MicroRNAs(miRNAs)是一类微小非编码RNA,通过与靶基因mRNA序列的 3’非翻译区互补结合,从而负性调控靶基因的转录与功能,现有研究证明miRNAs参与多种生理及病理过程[2-3]。已有研究证明多种miRNAs与年龄相关性白内障的发病相关,因此miRNAs可能成为白内障诊断和治疗的新靶点[4]。生物学软件预测miR-138可能与SIRT1存在靶向关系,因此本研究检测miR-138和SIRT1在年龄相关性白内障晶状体组织中的表达水平,并进而阐明miR-138靶向作用SIRT1调控人晶状体上皮细胞增殖、凋亡,揭示miR-138在年龄相关性白内障发病过程中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 选择2016年1月至8月在中国医科大学附属第四医院诊断为年龄相关性白内障并行超声乳化白内障吸出术的患者(排除其他眼部疾病),于术中收集新鲜晶状体前囊膜标本(白内障组)46例46眼,其中男21例,女25例,年龄53~72(61.23±9.41)岁。新鲜透明晶状体前囊膜(正常对照组)24例24眼来源于中国医科大学附属第四医院眼科眼库,供体无白内障、青光眼、虹膜炎等眼部疾病,其中男9例,女15例,年龄49~68(59.12±6.17)岁。所有标本取材后立即保存于液氮中。本实验经中国医科大学附属第四医院伦理委员会批准,研究对象知情同意并签署知情同意书。
1.2 试剂与仪器 体积分数10%胎牛血清(美国Gibco公司),100×103 U·L-1青霉素和100 g·L-1链霉素、miR-138的上下游引物和RNU6B引物、BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher公司),DMEM培养液、Trizol试剂、100 g·L-1 NuPAGETM Bis-Tris预制凝胶、Lipofectamine? RNAiMAX转染试剂盒(美国Invitrogen公司),TaqManTM MicroRNA反转录试剂盒、TaqManTM MicroRNA试剂盒、TaqMan Universal Master Mix II试剂盒(美国Applied Biosystems公司),PrimerScriptTM 反转录试剂盒 (日本Takara公司),SIRT1引物及β-actin引物(上海生物工程公司),RIPA蛋白裂解液 (美国Pierce公司),兔抗人SIRT1、兔抗人GAPDH单克隆抗体、Caspase-3活性检测试剂盒(美国Abcam公司),HRP标记羊抗兔IgG(H+L)二抗、pGL3-Promoter 载体、双荧光素酶报告检测系统 (美国Promega公司),采用ABI 7500实时荧光定量PCR仪(RT-PCR仪,美国Applied Biosystems公司)进行RT-qPCR反应。
1.3 细胞培养 人晶状体上皮细胞系(SRA01/04)由美国Doheny眼科研究所Yi-sin Liu教授惠赠。培养于含有体积分数10%胎牛血清、含100×103 U·L-1青霉素和100 g·L-1链霉素的DMEM培养液中,置于37 ℃、体积分数5% CO2的恒温培养箱中。
1.4 RT-qPCR检测 采用Trizol试剂提取细胞内总RNA,反转录获得microRNA cDNA,检测miR-138的表达量,以RNU6B作为内参。反转录获得cDNA,检测SIRT1的mRNA表达水平,β-actin作为内参。SIRT1引物序列:上游引物:5’-TCGGCAGGTCCCTTTGTCATCC-3’,下游引物:5’-TGCAGGTCAACTGGTGTCGT-3’;β-actin引物序列:上游引物:5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’,下游引物:5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。经过3次独立实验,采用2-ΔΔCt法定量分析相对表达量。
1.5 Western blotting检测 采用加入蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液提取总蛋白,定量蛋白浓度后,每孔40 μg蛋白上样,100 V电压下90 min进行电泳分离蛋白,然后将蛋白转移至PVDF膜,50 g·L-1 脱脂奶粉溶液室温下封闭1 h,兔抗SIRT1(1∶1000)、兔抗GAPDH(1∶2000)4 ℃下孵育过夜。HRP标记羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶2500)室温下孵育2 h。ECL发光反应后,采用Image J软件定量分析蛋白条带。
1.6 细胞转染 将SRA01/04 细胞接种于24孔细胞培养板,每孔1000个,分为4组:模拟物阴性对照组、miR-138模拟物组、抑制物阴性对照组和miR-138抑制物组。24 h后进行转染,模拟物阴性对照组:每孔加入1.5 μL Lipofectamine? RNAiMAX+0.7 μL模拟物阴性对照物(20 μmol·L-1);miR-138模拟物组:每孔加入1.5 μL Lipofectamine? RNAiMAX+0.7 μL miR-138模拟物(20 μmol·L-1);抑制物阴性对照组:每孔加入1.5 μL Lipofectamine? RNAiMAX+0.7 μL抑制物阴性对照物(20 μmol·L-1);miR-138抑制物组:每孔加入1.5 μL Lipofectamine? RNAiMAX+0.7 μL miR-138抑制物(20 μmol·L-1)。转染完成72 h后,进行相应后续实验。
1.7 双荧光素酶报告基因检测 以人cDNA文库为模板,扩增获得含有预测miR-138结合区域的野生型SIRT1 3’-UTR序列,将此片段克隆入荧光素酶报告载体获得野生型荧光素酶报告基因载体(pGL3-SIRT1-野生型)。在野生型SIRT1 3’-UTR片段突变预测的miR-138结合区域,将此片段克隆入荧光素酶报告载体同一位置,获得突变型荧光素酶报告基因载体(pGL3-SIRT1-突变型)。接种于24孔细胞培养板后24 h,按照Lipofectamine? RNAiMAX转染试剂盒说明书向SRA01/04细胞中共转染荧光素酶报告基因载体和miR-138抑制物,分为四组:pGL3-SIRT1-野生型+抑制物阴性对照组、pGL3-SIRT1-野生型+miR-138抑制物组、pGL3-SIRT1-突变型+抑制物阴性对照组、pGL3-SIRT1-突变型+miR-138抑制物组。转染完成后72 h,采用双荧光素酶报告检测系统检测各组的相对荧光素酶活性,以海肾荧光素酶活性作为内参,重复3次独立实验。
1.8 Caspase-3活性检测 采用Caspase-3 活性检测试剂盒检测Caspase-3活性。SRA01/04细胞转染后72 h,暴露于200 μmol·L-1 H2O2 1 h后,按照说明书使用裂解液与冰上裂解细胞,离心,取上清,使用BCA法测定蛋白浓度。96孔板中依次加入50 μL待测样品,50 μL缓冲液,0.5 μL二硫苏糖醇,5 μL Caspase-3催化底物天冬氨酸-谷氨酸-颉氨酸-天冬氨酸-对硝基苯胺(DEVD-p-NA),37 ℃孵育2 h后,使用酶标仪在405 nm波长处检测吸光度(A)值。每组设3个复孔,实验重复3次。以对照组Caspase-3活性为1,Caspase-3相对活性为(实验组A值-空白孔A值)/(对照组A值-空白孔A值)×100%。
1.9 统计学处理 数据以均数±标准差表示,用SPSS 16.0软件进行统计学处理,两组均数比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-138在年龄相关性白内障患者晶状体囊膜中的表达 RT-qPCR检测miR-138的表达水平结果表明,相对于正常对照组,白内障组miR-138表达(3.64±0.19)水平显著升高(P<0.001,图1)。



2.2 SIRT1在年龄相关性白内障患者晶状体囊膜中的表达 RT-qPCR检测SIRT1 mRNA表达水平结果表明,与正常对照组比较,白内障组SIRT1 mRNA表达水平(0.32±0.06)显著下降(P<0.001,图2)。
2.3 miR-138调控人晶状体上皮细胞中SIRT1表达 RT-qPCR检测SIRT1的mRNA表达水平,Western blotting检测SIRT1蛋白表达水平,发现与模拟物阴性对照组比较,miR-138模拟物组SIRT1的mRNA表达水平明显降低(P<0.001,图3),蛋白表达水平亦明显降低(P<0.05,图4A-4B)。与抑制物阴性对照组比较,miR-138抑制物组SIRT1的mRNA表达水平显著升高(P<0.001,图3),蛋白表达水平显著升高(P<0.05,图4C-4D)。





2.4 SIRT1为miR-138的靶基因 首先利用在线生物软件miRanda预测SIRT1可能为miR-138的靶基因(图5A),然后采用双荧光素酶报告基因检测系统确证SIRT1为miR-138的靶基因。结果表明,与pGL3-SIRT1-野生型+抑制物阴性对照组比较,共转染pGL3-SIRT1-野生型+miR-138抑制物组相对荧光素酶活性均显著升高(均为P<0.001,图5B)。与pGL3-SIRT1-突变型+抑制物阳性对照组比较,共转染pGL3-SIRT1-突变型+miR-138抑制物组相对荧光素酶活性均无明显变化(均为P>0.05,图5B),证明SIRT1为miR-138的直接作用靶点。
2.5 miR-138对人晶状体上皮细胞凋亡的调控 各组Caspase-3活性检测结果表明,与模拟物阴性对照组比较,miR-138模拟物组Caspase-3活性明显升高(P<0.001,图6);与抑制物阴性对照组比较,miR-138抑制物组Caspase-3活性明显降低(P<0.001,图6),表明miR-138促进人晶状体上皮细胞凋亡。




3 讨论
    miRNAs是一类内源性非编码 RNA,由21~25个核苷酸组成,通过与靶基因的3’-UTR互补配对,抑制靶基因翻译或介导靶基因降解而调节基因表达[5]。miRNAs参与多种生理及病理过程,包括:细胞生长和凋亡、激素分泌、老化、器官发育和免疫应答等与许多疾病的发生发展密切相关[2,6]。已有研究表明miRNAs在眼部发育及眼科疾病中发挥重要作用,如白内障、青光眼、年龄相关性黄斑变性及脉络膜新生血管[7-9],可能成为眼科疾病诊断、预防及治疗的新靶点。本研究阐明了miRNA-138靶向调控SIRT1影响年龄相关性白内障发生和发展的作用机制。
    本研究发现miR-138在年龄相关性白内障患者中表达水平显著升高,提示miR-138可能参与年龄相关性白内障的发病及发展。miRNAs在白内障中的异常表达已有相关报道。Qin等[10]报道miR-125b在年龄相关性白内障晶状体囊膜中低表达并抑制人晶状体上皮细胞凋亡。另有研究表明miR-421[11]和miR-133b[4]在年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞中表达下降,miR-15a和miR-161表达升高[12]。miR-138被证实在多种肿瘤组织中低表达,发挥抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡的作用[13-15]。已知miRNAs的表达及功能具有高度的组织特异性和时间特异性,因此miR-138在人晶状体上皮细胞中的作用及机制仍需进一步研究。
    本研究发现SIRT1在年龄相关性白内障患者中表达水平显著下降,提示SIRT1可能参与年龄相关性白内障的发病及发展,并与miR-138存在相互作用。SIRT1基因编码蛋白为NAD+依赖性蛋白去乙酰化酶,属于人Sirtuin蛋白家族,在各物种均具有高度保守性,几乎存在于机体所有类型细胞中[16]。SIRT1能够乙酰化p53从而降低 p53诱导细胞凋亡的能力[17]。Calapre等[18]研究表明激活SIRT1可以促进p53的乙酰化,从而抑制DNA损伤引起的细胞凋亡。在成骨细胞中过表达SIRT1能够抑制低氧诱导的凋亡[1]。SIRT1在多种病理条件下通过抑制炎症、凋亡和氧化应激发挥保护作用。然而SIRT1在白内障中的作用机制仍不明确。
    本研究利用在线生物软件TargetScan预测SIRT1可能为miR-138的靶基因,然后向晶状体上皮细胞系瞬时转染miR-138 模拟物上调miR-138,SIRT1表达水平显著下降;瞬时转染miR-138 抑制物下调miR-138,SIRT1表达水平显著上升,进一步证实miR-138调节晶状体上皮细胞中SIRT1表达,SIRT1和miR-138之间可能存在靶向关系。最后采用双荧光素酶报告基因检测系统确证SIRT1为miR-138的直接作用靶点。随后向晶状体上皮细胞系分别转染miR-138 模拟物和miR-138抑制物后暴露于200 μmol·L-1 H2O2 1 h诱导凋亡,结果发现过表达miR-138组Caspase-3活性明显升高,抑制miR-138组Caspase-3活性显著下降,说明miR-138诱导晶状体上皮细胞凋亡。以上结果表明,在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中miR-138通过靶向性抑制SIRT1表达,促进晶状体上皮细胞凋亡,从而在白内障发生发展中发挥重要作用。
    综上所述,miR-138在年龄相关性白内障患者晶状体囊膜中高表达,miR-138通过靶向性负性调控SIRT1表达,促进晶状体上皮细胞凋亡,从而在白内障发生发展中发挥关键性作用,随着研究的进展,miR-138有望成为白内障诊断和治疗的新靶点。