《眼科新进展》  2018年2期 106-110   出版日期：2018-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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龙胆泻肝汤对葡萄膜炎大鼠Notch信号通路的干预作用


    葡萄膜炎是一类眼科常见、严重危害视觉健康的复发性自身免疫性疾病。据统计，我国葡萄膜炎患病率占眼病的5.7%～8.2%，大约有500万人罹患此病，并呈逐年上升趋势^［1］。Notch信号通路是调节机体炎症反应和自身免疫性疾病发展的重要通路，可通过调控相关细胞因子的表达水平诱导细胞分化，进而影响机体的免疫状态。在免疫性血小板减少症中调节失活的Notch信号可以扭转Treg-Th17细胞的比例失衡状态^［2］。有研究证实，过敏性哮喘患儿外周血中存在Th17/Treg细胞失调，这种变化伴随着Notch1的表达，说明Th17/Treg比例失调与Notch表达升高有关^［3］。不同时间给予C57BL/6 葡萄膜炎小鼠Notch信号通路阻断剂，均可抑制葡萄膜炎的发展^［4］。B10.RIII 葡萄膜炎小鼠Notch 信号通路中Notch1、Notch4、Dll4及NICD等均表达上调。腹腔注射Notch 信号通路阻断剂DAPT可明显减轻葡萄膜炎的发病程度^［5］。
    龙胆泻肝汤源自《医方集解》，方由龙胆草、柴胡、泽泻、车前子、生地、木通、当归、栀子、黄芩、甘草十味药物组成。其中龙胆草为君，栀子、黄芩为臣，柴胡、泽泻、车前子、生地、木通、当归、甘草为佐，诸药共奏清泻肝胆实火、清利肝经湿热的功效^［6］。研究表明，龙胆泻肝汤能够通过多种途径改善机体免疫反应，从而有效减少实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAV）大鼠前房炎症细胞浸润，减轻炎症，保护眼部组织结构，促进机体免疫功能恢复^［7］。但是，龙胆泻肝汤对葡萄膜炎Notch信号通路相关基因表达的影响尚不清楚。本研究拟通过流式细胞仪检测脾脏和淋巴结中Th17/Treg细胞的比例变化，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测大鼠脾脏和淋巴结中Notch信号通路Notch1、Notch2、Notch3、Notch4基因的表达水平变化，ELISA方法检测Notch信号通路相关蛋白的表达情况，以进一步探讨龙胆泻肝汤治疗葡萄膜炎的作用机制。
1　材料与方法
1.1　实验动物及处理　24只成年健康Lewis大鼠（6~8周，体质量160~180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司）用随机数字表法分为正常对照组、EAU模型组和龙胆泻肝汤干预组，每组各8只。EAU模型组和龙胆泻肝汤干预组大鼠在后肢足垫、两侧腹壁及躯干上皮下各点共注射200 μL含有光感受器间维生素A结合蛋白（1177-1191）、结核分枝杆菌H37RA（tuberculin，TB）、完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant，CFA）和无菌PBS的乳糜液诱导EAU；正常对照组大鼠在相同的部位注射等剂量只含TB和CFA的乳糜液。龙胆泻肝汤干预组大鼠自诱导造模后第1天起，每只大鼠给予1000 mg·kg^-1·d^-1龙胆泻肝汤（大鼠使用剂量为临床等效剂量折算的5倍）灌胃处理，每日1次，直至大鼠处死。在免疫后12 d每组随机选取4只大鼠，取其脾脏和淋巴结用qRT-PCR及ELISA方法检测Notch基因和蛋白表达情况；另外4只大鼠分别取脾脏和淋巴结收集CD4⁺T细胞，用于流式细胞术检测Th17、Treg细胞的水平测定。
1.2　主要试剂及仪器　光感受器间维生素A结合蛋白（1177-1191；氨基酸序列：ADGSSWEGVGVVPDV，上海生工生物工程股份有限公司合成）；TB（美国Difco公司）；CFA（美国Sigma公司）；龙胆泻肝汤配方颗粒（产品批号：1311007W，华润三九医药股份有限公司）；microRNA组织/细胞快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）；cDNA逆转录试剂盒、2×SYBR Green I试剂盒和LightCycler^?480 qRT-PCR仪（购自美国Roche公司）；大鼠Notch蛋白 ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司）；流式细胞仪（BD FACSVerseTM，美国）；FITC-CD4、PE-IL-17、APC-CD25、PE-Foxp3（美国eBioscience公司）；miRNA转染试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）；固定破膜试剂盒（美国BD公司）。
1.3　Genesis-D眼底相机观察大鼠眼底炎症表现　大鼠免疫后用Genesis-D眼底相机每天观察大鼠眼底炎症表现，并记录相关结果。
1.4　流式细胞仪检测脾脏和淋巴结中Th17/Treg细胞比例变化　将三组大鼠脾脏和淋巴结研磨后分别离心，尼龙毛过滤收集细胞，然后用大鼠淋巴细胞分离液分离得到的单核细胞（每组约10⁶个细胞）。-80 ℃冰箱取出cocktail细胞刺激液，37 ℃水浴解冻。加入6 μL cocktail刺激液和4 μL Golgistop蛋白转运抑制剂，移液器轻轻吹打混匀。用锡箔纸严密包裹，放入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中避光孵育5 h；孵育后进行细胞表面染色，固定破膜后进行胞内染色。染色后滤网过滤，流式细胞仪检测大鼠脾脏和淋巴结中Th17、Treg细胞水平及二者比例并分析结果。
1.5　qRT-PCR检测脾脏和淋巴结中Notch基因的表达　脾脏和淋巴结用液氮研磨，取适量研磨后的组织按照组织RNA快速提取试剂盒说明书提取总RNA，用K5600分光光度计检测RNA的纯度和浓度（A₂₆₀/A₂₈₀为1.8~2.1）。提取的RNA用cDNA反转录试剂盒合成cDNA，进行qRT-PCR检测（20 μL反应体系，每个基因设3个复孔）。β-actin作为Notch1~4基因的内参。引物序列分别为：β-actin上游引物：5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’，下游引物：5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’；Notch1上游引物：5’-ATGGCCCCACCTGCAGACAA-GATG-3’，下游引物：5’-GGCACGGCAGGCACAGCG-ATAG-3’；Notch2上游引物：5’-GCAGCCGCCGTCAATAATGTGG-3’，下游引物：5’-GTCCCGGTTGGCAAAGTGGTCTAA-3’；Notch3上游引物：5’-GCGGGTGGCCAGTGCATAGACAA-3’，下游引物：5’-GCCAGGGGGACAGGA-GCAGAGATA-3’；Notch4上游引物：5’-GGGGCTGCGCTGTGAGGGGGATGT-3’，下游引物：5’-CTCG-GGGCAGCGGCAGGTGAAG-3’。反应条件为：95 ℃、5 min，循环1次；95 ℃、20 s，55 ℃、25 s，60 ℃、25 s，循环45次。qRT-PCR检测结束后，按照2^-ΔΔCt计算各基因表达水平，并对各组数据进行统计学分析。
1.6　ELISA检测脾脏和淋巴结中Notch相关蛋白的表达水平　分别取三组大鼠的脾脏和淋巴结，用液氮研磨至细粉状，加入350 μL TRI pure裂解。然后用超声波细胞粉碎机冰上超声20 min，超声后8000 r·min^-1、4 ℃离心20 min。取上清测定蛋白浓度，然后用ELISA试剂盒检测相关Notch蛋白的表达水平。
1.7　统计学分析　所有实验均重复三次，所得数据采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料均以x?±s表示，经Levene检验方差齐。统计学差异比较均采用单因素方差分析，各组间的两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　大鼠眼底炎症表现　在大鼠免疫后12 d，Genesis-D眼底照相机观察发现EAU模型组大鼠出现明显眼底炎症，表现为虹膜血管严重充血扩张，前房重度混浊，纤维素性渗出、积脓，瞳孔膜闭。而龙胆泻肝汤干预组大鼠炎症表现轻于EAU模型组，仅表现为虹膜血管轻度扩张充血（图1）。



2.2　三组大鼠脾脏和淋巴结中Th17/Treg细胞比例变化　流式细胞仪分别检测三组大鼠脾脏和淋巴结中Th17、Treg细胞的表达水平，发现与正常对照组大鼠的细胞水平相比，免疫后12 d的EAU模型组大鼠中Th17细胞水平明显升高，而Treg细胞水平明显下降，Th17/Treg比例显著增高，呈现不平衡表达；龙胆泻肝汤干预组大鼠的Th17细胞水平较EAU模型组明显降低，而Treg细胞水平显著升高，Th17/Treg比例逐渐恢复平衡，差异均有统计学意义（图2-图4）。
2.3　三组大鼠脾脏和淋巴结中Notch1、Notch2、Notch3、Notch4基因的表达　qRT-PCR检测发现（图5），EAU模型组大鼠脾脏和淋巴结中Notch1、Notch2、Notch4基因的表达水平均显著高于正常对照组大鼠（均为P<0.01）；龙胆泻肝汤干预组大鼠脾脏和淋巴结中Notch1、Notch4基因的表达虽然高于正常对照组（均为P<0.01），但显著低于EAU模型组（均为P<0.01）；Notch3基因在三组大鼠的脾脏和淋巴结中均未检测到有表达；与EAU模型组Notch2基因表达相比，龙胆泻肝汤干预组Notch2基因表达虽有下降，但差异无统计学意义（P>0.05）。







2.4　大鼠脾脏和淋巴结中Notch1、Notch2和Notch4蛋白的表达　由于在qRT-PCR中未检测到Notch3基因的表达，因此我们用ELISA方法检测了大鼠脾脏和淋巴结中Notch1、Notch2和Notch4蛋白的表达。结果发现，龙胆泻肝汤干预组大鼠脾脏和淋巴结中Notch1、Notch2和Notch4蛋白在免疫后12 d均显著高于正常对照组（均为P<0.01），但明显低于EAU模型组（均为P<0.01；图6）。
3　讨论
    nave CD4⁺T淋巴细胞接收抗原刺激信号，在共刺激信号分子的作用下活化，并在不同条件下分化成不同亚型的T淋巴细胞。白细胞介素（interleukin，IL)-6与转化生长因子-β是决定nave CD4⁺T淋巴细胞向Th17或Treg细胞分化的关键细胞因子^［8］，而Th17、Treg在分化上相互联系，在功能上相互拮抗^［9］。Th17细胞已被证实在EAU发生发展中起重要作用^［10］。临床研究证实，Th17/Treg细胞比例异常在EAU发病中发挥重要作用。Treg细胞数量减少或功能紊乱、Th17/Treg细胞失衡均可导致EAU的发生^［11-12］。有研究已证实EAU大鼠Th17/Treg细胞比例失衡与EAU病程发展密切相关^［13］。因此，Th17/Treg比例变化可影响机体免疫反应、调控EAU的发生发展。Notch信号通路是维持机体免疫平衡的重要信号通路，能通过调节相关细胞因子的表达水平诱导细胞分化。研究发现，经特异性γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路后，通路中Jagged-1信号分子可显著降低CD4⁺T细胞中ROR-γt的表达并下调与Th17相关的炎性细胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23a和IL-12rb1的表达水平，进而抑制CD4⁺T细胞向Th17细胞分化，提示Notch信号在Th17细胞的分化中发挥重要作用^［14］。Jiao等^［15］发现，DAPT可显著减少nave T细胞向Th17细胞分化，抑制Th1和Th17细胞在脾脏和淋巴结中的应答，减少血清中干扰素-γ和IL-17的水平。免疫性血小板减少症患者用DAPT阻断Notch信号通路后，其外周血中Th17细胞和Th17/Treg比例均显著降低，同时伴随IL-17和RORγt mRNA表达的减少^［16］。上述结果表明，Notch信号分子通过调控nave CD4⁺T细胞向Th17、Treg细胞分化，在Th17/Treg平衡中发挥重要作用。有实验发现，不同时间给予C57BL/6 EAU小鼠Notch信号通路阻断剂，均可抑制EAU的发展，B10.RIII EAU小鼠Notch信号通路中Notch1、Notch4、Dll4及NICD 等均表达上调^［4］。临床证实，活动性Behcet患者Notch信号分子高度激活，并伴随Th17高水平应答，阻断Notch信号通路可选择性抑制Th17应答^［17］。
    白桦等^［18］研究发现，龙胆泻肝汤可显著抑制带状疱疹患者外周血中Th17 细胞的表达，减少IL-6、IL-17、IL-23的分泌，改善患者的免疫功能。我们前期研究表明，龙胆泻肝汤能有效减轻EAU大鼠前房炎症反应，减少炎症细胞浸润，保护眼部组织结构，增强机体抗氧化能力，调节免疫状态^［19］，其机制可能通过抑制干扰素-γ、IL-17和肿瘤坏死因子-α相关炎症因子的表达发挥其抗炎作用，促进IL-10的表达，加速自身免疫炎症的恢复，从而有效治疗EAU^［20］。本研究我们发现，与正常对照组相比，EAU大鼠免疫后12 d Th17/Treg比例明显失衡，脾脏和淋巴结中Notch1、Notch2和Notch4的表达异常增高，提示EAU的发生可能与Notch信号通路的活化有关；龙胆泻肝汤干预EAU大鼠后，Notch信号通路相关分子表达水平降低，Th17/Treg比例失衡状况减轻，因而推测龙胆泻肝汤可通过调节Notch信号通路相关基因的表达调控nave CD4⁺T淋巴细胞向Th17和Treg细胞分化，改善Th17/Treg比例，从而有助于机体的免疫功能恢复，进而减轻EAU大鼠的炎症表现，影响EAU的发展进程。本研究为临床应用龙胆泻肝汤治疗EAU提供了新的干预靶点和思路，但是龙胆泻肝汤调控nave CD4⁺T淋巴细胞向Th17和Treg细胞分化的详细作用机制还需要进一步研究。