《眼科新进展》  2018年2期 101-105   出版日期：2018-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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苯扎溴铵和西酞普兰对小鼠角膜上皮和角膜全层厚度的影响


    目前滴眼剂大多使用多剂量包装，为更好地保证滴眼剂的用药安全，使其在使用过程中保证无菌，防止其给用药安全带来极大隐患，多剂量的滴眼剂均加有抑菌剂。而苯扎溴铵是由溴化二甲基苄基烃铵同系物所组成的混合物，在滴眼剂中广泛用作抑菌剂，防止眼用制剂被微生物污染^［1］。但长期使用含苯扎溴铵的滴眼剂对眼部有不同程度的不适感，甚至产生不同程度眼表变化，导致眼部不适、泪膜不稳定、结膜鳞状化生、杯状细胞丧失、炎症等^［2-5］。有研究表明，苯扎溴铵对眼表有一定的毒性^［6］，但其对角膜厚度的具体影响还犹未可知。而西酞普兰作为治疗抑郁症的药物，在其药物试验中的不良反应评估中，往往通过患者的自发报告症状列表进行，眼部相关症状在抗抑郁药物的临床试验报告中不常见^［7］。因此，西酞普兰对角膜的相关影响还难以确定。
    光学相干断层扫描血管造影（optical coherence tomography angiography，OCTA）作为快速的、非侵入性的新型血流成像技术，能直接检测到眼部病变范围、深度及新生血管长度、口径大小、面积等变化^［8］。本实验旨在应用OCTA测量苯扎溴铵对小鼠角膜上皮和角膜全层厚度的影响，为苯扎溴铵对眼表结构及功能的影响提供理论基础。
1　材料与方法
1.1　实验动物　本研究使用体质量18~21 g、鼠龄6~8周的小鼠（均为SPF级实验动物）。在南昌大学医学院动物实验中心，将小鼠隔离并饲养1周，随机选取符合质量和年龄标准的小鼠共60只，对其行眼科相关检查，确保所选小鼠无眼表疾病。在整个研究中，保持在标准化的环境中饲养：恒温为（23±1）℃，相对湿度60％±5％，交替12 h黑暗周期（上午8∶00至晚上8∶00）。本研究实验符合动物伦理委员会的要求^［9］，对实验动物的利益进行了充分的考虑，尽可能减少实验动物的应激、痛苦和伤害，处置动物时尽量减少实验动物的痛苦。
1.2　检查方法　应用AngioVue OCTA系统（Optovue，Inc.，Fremont，CA），模式设置为AngioRetina模式（视网膜成像模式），横向分辨率设置为15 μm，轴向分辨率设置为5 μm，采用840 nm波长、宽度22 μm的光源获取3D扫描图像^［10］。采用分频辐去相关血管造影算法（split-spectrum amplitude-decorrelation angiography，SSADA）进行成像^［11］。确定扫描中心，关闭自动聚焦功能，对所选小鼠进行检测，为控制变量，所有操作均由同一人完成。
1.3　实验材料　将西酞普兰粉末（citalopram HBr，Selleckchem公司）与生理盐水以1∶100的比例混合制成混悬液，将其保存于4 ℃冰箱备用。为避免温度过低对小鼠造成刺激，在注射前将其复温至室温。苯扎溴铵溶剂购自Sigma公司（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）。
1.4　实验动物分组　对所选的60只小鼠随机均分为5组，每组12只（均为右眼），其中A组为阴性对照组，不做任何处理；B组PBS眼液滴眼，每天3次；C组为苯扎溴铵组：苯扎溴铵眼液滴眼（1 g·L^-1），每天3次；D组为西酞普兰组：于每天上午8时，腹腔注射西酞普兰混悬液，注射剂量为10 mg·kg^-1体质量；E组为混合组：苯扎溴铵眼液滴眼，每天3次；腹腔注射西酞普兰混悬液，注射剂量为5 mg·kg^-1体质量。在注射（滴眼）后2周，利用OCTA分别测量5组小鼠的角膜上皮和角膜全层厚度。利用系统软件，以扫描中心为圆心将角膜划分为17个区域：将圆形扫描区域按直径2 mm、5 mm、6 mm的圆形区域划分，分别作为角膜中央、内环和外环。同时，按上侧（S）、鼻上侧（SN）、鼻侧（N）、鼻下侧（IN）、下侧（I）、颞下侧（IT）、颞侧（T）、颞上侧（ST）对内环和外环均分为17个区域，对各区域角膜厚度进行测量（图1）。
1.5　测量与分析　为测量角膜上皮和角膜全层各区域的局部厚度和变化量，应用OCTA对所选的各组小鼠的角膜中央直径2 mm区域和内环、外环各分区进行检测并分析，叠加双眼数据后，将各区域角膜上皮和角膜全层厚度的平均值制成图形。
1.6　统计学分析　本研究统计分析采用SPSS 17.0处理实验数据，数据采用x?±s表示，完全随机设计资料的方差分析比较角膜上皮厚度和角膜全层厚度，计数资料用χ²检验，检验水准均为α=0.05；两组间均数比较采用Mann-Whitney U检验，以P<0.05为差异有统计学意义。



2　结果
2.1　各组小鼠角膜上皮厚度和角膜全层厚度的测量结果　A、B、C、D、E五组利用OCTA分别在注射后2周对各组小鼠右眼角膜全层厚度进行测量，各组小鼠角膜前节情况见图2。注射后2周与注射前相比，A组、B组及D组角膜上皮厚度及角膜全层厚度略有变化，但差异均无统计学意义（均为P＞0.05）；注射后2周与注射前相比，C组和E组各区域角膜上皮厚度及角膜全层厚度明显增厚，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。注射后2周，D组与A组和B组相比，角膜上皮厚度及角膜全层厚度无明显改变，差异均无统计学意义（均为P＞0.05）；注射后2周，E组与C组相比，角膜上皮厚度及角膜全层厚度增厚更为显著，差异有统计学意义（P＜0.05；见表1和表2）。





2.2　不同时间点各组角膜上皮厚度和角膜全层厚度比较　A、B、C、D、E五组在注射后2周，分别测量角膜上皮厚度和角膜全层厚度的各区域平均值，采用重复测量数据的方差分析，结果见表3和表4，结果显示：（1）各组注射后与注射前相比，C组和E组角膜上皮厚度和角膜全层厚度明显增大，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）；A组、B组、D组角膜上皮厚度和角膜全层厚度略有增大，差异均无统计学意义（均为P＞0.05）；（2）与A组相比，C组和E组角膜上皮厚度和角膜全层厚度明显增大，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）；与A组相比，D组角膜上皮厚度和角膜全层厚度无明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）与C组相比，A组、B组、D组角膜上皮厚度及角膜全层厚度均明显变薄，而E组角膜上皮厚度及角膜全层厚度明显增厚，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。




3　讨论
    OCTA作为一种非接触性的成像系统，具有扫描快、无创、高分辨等特点，可以在不使用任何染料的情况下，评估角膜病理特征，发现角膜各区域厚度具有的差异性。本研究利用OCTA初步分析了苯扎溴铵及西酞普兰对小鼠角膜上皮和角膜全层厚度的影响。
    目前，大多数滴眼液均使用苯扎溴铵作为防腐剂，通过抑制细菌来达到维持药物功效、延长药物的寿命的目的^［12］，但有研究表明，苯扎溴铵对眼表有一定的毒性^［13-15］，在一定程度上可加速促炎细胞因子分泌，增加了对眼表细胞的损伤^［16-17］。在各种动物模型中，苯扎溴铵的使用导致小鼠、大鼠和兔的泪膜稳定性下降，角膜和结膜上皮破裂，角膜新生血管形成和炎症反应等损伤，从而造成干眼^［18-19］。
    苯扎溴铵是所有多剂量滴眼液配方的重要组成部分，它可以诱导角膜上皮功能障碍，即使在非常低的剂量下也可能损害角膜上皮屏障。在体内和体外不同研究之间，损伤眼表面所需的苯扎溴铵的浓度变化有很大的差异^［20］。一般来说，滴眼液中苯扎溴铵的浓度范围为0.04~0.10 g·L^-1，长期使用可能会导致眼表损伤^［21］。苯扎溴铵可以被降解为过氧化氢，从而引起氧化应激并引发角膜和结膜上皮细胞中的炎症反应。即使在低浓度下，苯扎溴铵可以诱导如IL-1、IL-6、HLA-DR和TNF-α等炎症因子的表达水平显著增加^［21-22］。同时，由苯扎溴铵引起的干眼的泪液渗透性高，可刺激炎症细胞因子的产生^［23-24］。
    而西酞普兰是一种抑制快动眼睡眠的治疗抑郁症的药物，研究均报道了使用抗抑郁药物和干眼症风险之间的密切联系^［25-26］。此外，对抑郁症患者干眼症极少进行系统的研究。因此，探究西酞普兰对角膜的影响很大程度上可以为干眼症的诊断提供实验依据。但本实验发现，单纯应用西酞普兰对角膜厚度的影响并不显著，这可能是由于西酞普兰的应用影响睡眠，并且使得泪液蒸发增强，从而对泪膜的稳定性造成影响而导致了干眼症状的出现，而未对角膜造成损伤。其造成干眼症与除抗胆碱能系统以外的机制相关。
    本实验结果发现，苯扎溴铵和西酞普兰的联合应用后，角膜上皮及角膜全层的厚度的增加较单独应用苯扎溴铵时更为显著。因此，西酞普兰所导致的泪膜不稳定和苯扎溴铵具有协同效应，在一定程度上加剧了苯扎溴铵对角膜的损伤。
    总之，在苯扎溴铵和西酞普兰的联合应用中，角膜厚度增加更为显著。因此，在苯扎溴铵和西酞普兰的联合应用下，其对眼表的损伤加重，但其引起炎症反应和细胞损伤后再生等机制还有待进一步探究。