《眼科新进展》 2017年11期
1093-1096
出版日期：2017-11-05
ISSN:1003-5141
CN:41-1105/R
骨髓间充质干细胞与角膜损伤修复的研究现状
角膜位于眼球的前表面，其组织结构极其规则致密，容易受到如机械、感染、遗传、酸碱烧伤、炎症刺激、自身免疫性疾病等［1］多种内源性和外源性致病因素的损害，严重者可影响视力和外观。根据世界卫生组织统计，全球约有490万人因角膜疾病致盲［2］。目前有研究认为约80%的角膜盲可以通过预防和早期治疗得到避免。但当各种预防和早期治疗手段都无法成功时，角膜移植手术就成了治疗严重角膜疾病最为有效的手段［3］。目前随着医疗水平的提高，角膜移植手术在全球范围内得到开展。然而目前我国角膜移植手术的实施情况并不乐观。由于手术技术相对落后，加之传统观念的影响，现在我国每年仅能进行约1万台角膜移植手术［4］，远远无法满足角膜盲患者的需求。同时角膜移植手术面临着角膜供体严重缺乏、术后发生免疫排异反应等诸多问题。因此我们在大力倡导角膜捐献的同时，急需找到一种新的替代性的手段治疗角膜盲。
近年来随着组织工程学技术的发展，干细胞在角膜损伤修复和眼表重建方面的研究不断深入。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类位于骨髓基质细胞系中的非造血类成体干细胞，可广泛存在于体内各组织中，特别是在骨髓内含量最多。这种细胞因具有较强的增殖能力、多向诱导分化潜能［5］、促进组织修复以及体外操作简便［6］等优势，使其有望成为理想的组织工程角膜种子细胞来源。BMSCs具有多向分化潜能，可作为组织损伤修复的重要细胞来源，它还可以在损伤部位反应性分泌各种生长因子、趋化因子和蛋白酶等［7］，起到参与组织器官损伤修复的作用。现今BMSCs在急性肺损伤［8］、椎间盘损伤［9］、溃疡性结肠炎［10］、急性心肌梗死［11］、肝脏损伤［12］等多种器官或组织的体内外干细胞移植治疗研究中都取得了良好的效果。BMSCs应用于眼科疾病治疗的研究起步较晚。但近些年来随着各国眼科学研究者的共同努力，BMSCs在多种眼部疾病，如视网膜色素变性［13］、青光眼［14］、眶骨缺损［15］等的治疗应用研究中也取得了一定进展。同时，角膜疾病作为眼科领域的重要分支，尤其受到研究者的关注。为了明确BMSCs是否在角膜损伤中也具有一定的治疗作用，各国研究者进行了许多实验探索。本文将主要就BMSCs在眼表角膜损伤修复的基础研究和临床治疗等方面的研究进展进行综述。
1 BMSCs在角膜修复中的作用机制
1.1 BMSCs诱导分化为角膜上皮细胞 角膜上皮在维持整个角膜的透明度和无血管特性中扮演着重要的角色。BMSCs可以在眼表重建中发挥重要的作用。然而移植于眼表的BMSCs是通过何种机制发挥作用的，目前仍不十分清楚。Hu等［16］在实验研究中将大鼠角膜缘上皮细胞和大鼠BMSCs进行细胞共培养。并通过观察细胞形态、细胞增殖、流式细胞术和实时荧光定量PCR等方面进行检测，发现BMSCs可以促进角膜缘上皮细胞的存活和增殖，而这种影响可能是通过细胞旁分泌的方式进行的。Gu等［17］通过体内实验和体外实验分别证明了BMSCs可以分化为角膜上皮样细胞。在体内实验中，用BrdU对兔BMSCs进行标记并将其接种在纤维蛋白凝胶中，再移植于损伤的兔角膜表面，并于移植后第28天通过组织病理学和细胞分子生物学检测证实损伤的兔角膜得到了成功重建。BMSCs不仅参与了角膜上皮缺损的修复，且分化后的细胞能够表达角膜上皮细胞标志物CK3。在体外实验中，研究者将标记后的兔BMSCs与兔角膜缘干细胞进行细胞共培养，结果表明兔BMSCs可以迅速分化为形态学和分子表型上都符合的角膜上皮样细胞。同样也检测到分化后的兔BMSCs表达角膜上皮特异性标志物CK3。Jiang等［18］通过实验研究发现与大鼠角膜基质细胞共培养后的大鼠BMSCs可以向角膜上皮样细胞诱导分化。将这些细胞接种于羊膜上并进行移植可以有效地修复和重建碱烧伤后的大鼠角膜。Cejka等［19］研究了BMSCs和角膜缘上皮干细胞对角膜上皮细胞的抗氧化保护机制的作用的影响，以及干细胞对碱烧伤后角膜光学特性的影响，证明干细胞可以加速角膜上皮细胞再生修复，恢复抗氧化保护机制，以及修复角膜光学特征。
1.2 BMSCs诱导分化为角膜基质细胞 体外培养角膜基质细胞相对困难，因为在单层细胞培养基中生长的角膜基质细胞很快就会失去其固有的细胞形态，并且停止表达keratocan、lumican及ALDH1A1等角膜基质细胞特异性标志物。相比之下，BMSCs较容易在细胞培养基中扩增，并能够多向分化。Park等［20］研究以BMSCs作为组织工程化角膜组织细胞来源的可行性。他们将BMSCs置于角膜基质细胞培养基中培养，通过实时荧光定量PCR和Western blot检测证实培养于角膜基质细胞条件培养基中的BMSCs能够稳定表达lumican、ALDH1A1等角膜基质细胞标志物，这一结果证明角膜基质细胞培养基可以使BMSCs向角膜基质细胞样细胞分化。Harada等［21］将绿色荧光蛋白转基因小鼠的BMSCs通过体循环静脉注射于经放射照射后的野生型小鼠。两个月后通过荧光显微镜观察显示有大量荧光标记的干细胞聚集于角膜缘周围，角膜组织横截面的免疫组织荧光化学分析显示大部分经静脉注射后分布于此的BMSCs表达CD45或CD11b。分布于角膜基质的BMSCs中约有1%可以表达角膜基质细胞的特异性蛋白多糖。这一结果表明通过体循环静脉注射的BMSCs可以分化为角膜基质细胞。Liu等［22］也通过实验证明向角膜基质内移植BMSCs可能是一种有效的治疗因角膜基质细胞功能障碍而引起的角膜疾病的方法。
1.3 BMSCs诱导分化为角膜内皮细胞 在关于食管癌的研究中，研究者发现BMSCs可以分化为内皮细胞［23］。然而关于BMSCs分化为角膜内皮细胞的相关研究较少。刘小伟等［24］通过将标记后的新西兰兔自体BMSCs接种于明胶载体膜上，然后将接种有兔自体BMSCs的载体与机械去除了内皮细胞的自体兔角膜植片相黏合，原位缝合后进行BMSCs移植。结果通过免疫组织化学染色和电镜观察证实了移植后的自体BMSCs在角膜内表面可以分化为一种类似角膜内皮细胞形态和功能的细胞。Nakahara等［25］也通过实验证实了BMSCs培养基可以促进角膜内皮细胞的增殖。
1.4 BMSCs的抗炎及抗新生血管作用 随着研究的深入，BMSCs在多种组织器官损伤修复和抑制炎症反应等方面的作用得到证实，其在角膜损伤方面也有相似的作用，但其具体的抗炎和免疫调节机制目前尚不十分清楚。Cejkova等［26］将结合于纳米纤维支架材料的BMSCs移植于碱烧伤后的兔角膜，通过实验观察证实BMSCs可以有效地减少角膜细胞的凋亡，减少基质金属蛋白酶的分泌和炎性细胞因子产生。从而证明BMSCs可以减弱角膜炎症反应，同时减少新生血管形成，并显著加速角膜愈合。Oh等［27］进行了类似的实验，认为BMSCs对于化学损伤后角膜的抗炎、抗新生血管作用可能是通过IL-10、TGF-β1、IL-6及TSP-1等可溶性细胞因子介导的部分旁分泌途径实现的。在之后的研究中，Oh等［28］又发现人BMSCs可以有效刺激TSG-6表达上调，而TSG-6具有降低角膜混浊度和新生血管程度，减少炎性细胞浸润，使促炎因子、趋化因子及促新生血管因子表达下降的作用。这一研究发现，可能揭示了BMSCs的发挥抗炎作用的机制。
2 BMSCs在角膜损伤修复中的应用途径
2.1 全身应用途径 经静脉循环输注BMSCs的理论依据是该细胞对于损伤的组织和炎症反应部位具有归巢能力，可通过血液循环到达受损伤部位发挥作用，但这种归巢能力是有限的。研究者通过荧光蛋白标记发现，静脉注射BMSCs后的实验动物体内大部分靶器官中的BMSCs数量较低［29］。通过不同的动物模型验证，最终得出了一个共同的结论，体循环静脉输注的BMSCs最先聚积在肺部，之后大部分BMSCs可聚集于肝脏、脾脏、肾脏、骨髓［30］或是受损伤的部位［31］。Ye等［32］通过实验证明被标记的BMSCs可以通过循环系统进入碱烧伤损伤后的角膜，并向成纤维细胞样细胞分化，起到促进修复损伤的作用。Lan等［33］通过对小鼠角膜热损伤模型进行研究，于造模后1 h静脉输注被标记的BMSCs，结果在损伤后72 h通过免疫荧光显微镜在受损伤角膜中发现了BMSCs，而在作为对照的另一侧健康角膜中没有发现。从而证明静脉输注的BMSCs可以成功地聚集于受损伤的角膜，并起到修复作用。在损伤后第50天，研究者通过免疫荧光显微镜发现BMSCs仍旧存在于受损伤的角膜内，而不存在于对侧健康角膜，从而证明BMSCs不但能够聚积于受损伤的角膜，而且能够在损伤部位长期存在。Roddy等［34］也在角膜化学损伤模型中，通过腹腔注射和静脉输注BMSCs证实其可以减轻损伤角膜的炎症反应，并且证明这种作用主要是通过分泌抗炎蛋白TSG-6来实现的。另有一项国外多中心研究结果显示按照每千克体质量0.5×106~9×106个BMSCs细胞数为患者静脉输注BMSCs的安全的剂量范围，不会引起副作用［35］。
2.2 局部应用途径
2.2.1 羊膜 羊膜从细胞滋养层衍化而来，是人两层胎膜的内层，正常羊膜薄而透明，无血管［36］。因羊膜固有的生物学和免疫学特性，使得其在眼表疾病研究中得到了广泛的应用。眼科研究者以羊膜作为BMSCs的载体也进行了相关研究。为了检测是否移植人BMSCs可以重建角膜损伤，以及是否移植的BMSCs可以向角膜上皮样细胞分化。Ma等［37］将BMSCs在羊膜上增殖后移植于化学伤后7 d的小鼠角膜。结果显示移植后的BMSCs可以像角膜缘干细胞那样成功地修复损伤的角膜表面。另外，研究者还发现这种移植物的治疗效果主要是通过BMSCs抑制炎症和新生血管，而BMSCs向上皮细胞分化并不起主要作用。这一研究为BMSCs应用于修复损伤的角膜提供了第一手临床证据，为自体移植治疗角膜疾病找到了新的材料来源。Yam等［38］研究发现羊膜可以通过增强细胞内TIMPI影响的蛋白水解系统和细胞外基质的相互作用，以及减少转化生长因子β1和β2，以影响培养在羊膜表面的角膜缘上皮细胞的细胞因子的表达，从而有助于BMSCs的生长和分化。
2.2.2 异种脱细胞角膜基质 异种脱细胞角膜基质是利用猪、兔、牛等动物角膜通过反复冻融法、高静压技术、去污剂处理法、酶消化法、酸碱处理法等进行脱细胞处理后形成低免疫原性、含多种细胞因子、可塑性好、机械强度高的组织工程角膜支架材料。施文建等［39］通过将种植有人BMSCs的猪角膜基质移植于广泛损失的兔角膜，通过术后观察移植的BMSCs及猪角膜基质的存活、转归和角膜局部反应，利用免疫组织化学、免疫荧光化学染色检测移植后角膜上皮细胞角蛋白12的表达，证实异种脱细胞角膜基质移植片可以存活，BMSCs可以向角膜上皮样细胞分化，具有成为组织工程化角膜的潜能。
2.2.3 结膜下注射 Yao等［40］研究了结膜下注射BMSCs对于角膜碱烧伤急性期角膜损伤愈合的影响。研究者通过制作大鼠角膜碱烧伤模型后进行结膜下注射BMSCs治疗，证明这种方法可以加速角膜上皮愈合，减少炎症反应，减少新生血管形成。这种影响被认为是通过减少CD68+细胞的渗入，下调MIP-1α、TNF-α和VEGF因子的表达所造成的。Almaliotis等［41］利用兔角膜碱烧伤模型进行了类似的研究，对BMSCs改善角膜碱烧伤后的效果进行了评估。研究者通过角膜基质内注射和结膜下注射含有BMSCs的PBS液。通过与不含BMSCs的PBS组比较，利用裂隙灯观察角膜新生血管、混浊度和上皮缺损情况，以及检测谷丙转氨酶和血管内皮生长因子的浓度，免疫组织化学检测α-SMA和Ki-67的阳性水平。从而初步证明BMSCs对碱烧伤后的角膜具有治疗作用，并具有较好的临床疗效和预后效果。
3 小结
目前国内外对于BMSCs在角膜损伤修复方面的研究虽然取得了一定进展，但这些研究多数仍然处在细胞和动物实验阶段，离临床应用仍有较大距离。通过这些研究证明，BMSCs具有向角膜细胞分化的能力，同时也具有一定的抗炎抗新生血管和修复损伤的作用，但这些作用中的具体机制仍待进一步研究。目前在BMSCs的应用途径方面，局部移植途径相对更直接，作用部位更准确，干细胞耗损量更小。但在这一方法中，作为移植支架材料的组织相容性、机械强度仍需进一步提高。总的来说，目前BMSCs在角膜损伤修复方面的应用具有巨大的前景。