《眼科新进展》  2017年11期 1040-1043   出版日期：2017-11-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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DNA修复基因的多态性以及DNA损伤与年龄相关性白内障的关系


    年龄相关性白内障（age-related cataract，ARC）是引起老年人视力严重损害的主要原因之一，从而使其成为一个重要的公共卫生问题^［1-2］，ARC表现为晶状体逐渐混浊，从而导致视力渐进性下降直至最终致盲。根据晶状体混浊的部位可将ARC分为皮质型、核型、后囊下型和混合型四种类型。ARC是多个因素相互作用所引起的一种疾病。年龄、性别、吸烟、肥胖、紫外线辐射、慢性眼部炎症、雌激素过量或不足、高血压、糖尿病以及心血管疾病都可能加速ARC的发生与发展^［3］。近年来遗传因素对ARC发病的影响已成为国内外研究的热点。汉族人群中有报道OGG1、EPHA2以及谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）与皮质型ARC的发生发展存在相关性^［4-6］。ARC的确切病因和发病机制尚不十分清楚，但是目前公认氧化损伤在ARC的发生发展过程中起着重要作用。有理由大胆假设，DNA修复基因的多态性可能改变其修复DNA损伤的能力，从而导致年龄相关性疾病或者癌症等更严重疾病的发生^［7-8］。最近已有研究结果显示DNA修复基因的多态性与年龄相关性黄斑病变（age-related macular degeneration，AMD）以及青光眼的发生存在相关性^［9-10］。
    因此，本研究选择氧化损伤修复相关的BLM、WRN、ERCC6和OGG1基因的18个SNP位点，应用实时荧光PCR对“江苏眼病研究：阜宁县、滨湖区眼病流行病调查”人群中ARC患者以及对照人群进行基因分型，并探讨其与ARC的关系。
1　资料与方法
1.1　一般资料
1.1.1　ARC组　晶状体混浊程度按照LOCSⅢ分级系统进行分级并记录，至少一眼晶状体混浊，并存在两种及以上混浊类型，或双眼晶状体均混浊，归为混合型。入选标准：（1）晶状体混浊；（2）年龄≥50岁；（3）最佳矫正视力＜20/40。排除标准：（1）青光眼、高度近视、葡萄膜炎、糖尿病、眼部外伤或其他原因引起的白内障；（2）双眼中任一眼为人工晶状体眼或无晶状体眼。共收集789例（皮质型257例，核型366例，后囊下型34例，混合型132例）ARC患者纳入本研究。ARC患者中男315例，女474例，年龄为（70.38±7.72）岁，本研究遵循赫尔辛基宣言。所有参与者分别签署了知情同意书。此项研究经由南通大学附属医院伦理委员会批准。
1.1.2　对照组　对照组同样来自江苏眼病流行病学调查基地，且对照组与ARC患者间均无血缘关系。入选标准：（1）晶状体透明；（2）年龄≥50岁；（3）最佳矫正视力＞20/40。排除标准：（1）患有晶状体脱位、青光眼、近视、黄斑疾病、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎等其他眼病；（2）患有糖尿病、肾脏疾病、癌症等全身性疾病。要求对照组与ARC组患者年龄、性别均匹配，故最终共531人可纳入对照组，其中男240人，女291人，年龄为（69.66±4.51）岁，与ARC组患者年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2　方法
1.2.1　SNP位点的选择　通过国际人类基因组单体型图计划（HapMap）获得SNP位点基因型数据。运用HaploView软件分析并筛选出TagSNP。本研究SNP位点的选择遵循以下原则：（1）汉族人群中，稀有等位基因频率≥4%；（2）排除存在高度连锁不平衡性的突变位点（r²≤0.8）。采用酚-氯仿-异戊醇法提取外周血白细胞基因组的DNA。应用TaqMan-MGB试剂盒荧光探针技术进行基因型检测，每个DNA样本都进行3次重复实验。
1.2.2　彗星试验　彗星试验能有效地检测并定量分析细胞中DNA损伤的程度。在789例ARC患者中随机选取69例（皮质型32例，核型22例，混合型15例），531例对照组中选取年龄、性别均匹配的28例进行外周血淋巴细胞彗星试验。ARC患者年龄为（69.45±4.52）岁，对照组为（68.39±3.42）岁，差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.3　统计学分析　采用Stata 8.0软件进行统计分析，应用卡方检验比较所有ARC患者以及各亚型ARC和对照组等位基因频率，检验水准α=0.05，同时计算比值比（OR）和95％可信区间（95%CI），一旦P值＜0.05，则进行Bonferroni校正。对照组各位点基因型分布进行卡方检验从而检验其是否符合遗传平衡。对各位点进行不同的遗传模型分析（显性、隐形和杂合子优势遗传模型），本文仅列出有统计学意义的模型分析结果。彗星试验中ARC组与对照组各测量指标的比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　HWE检验结果及对照组和ARC组SNP频率分布　所有研究对象空腹血糖值均低于6.5 mmol·L^-1。除BLM-rs8027126外，其余SNP位点在对照组中的基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。如表1所示，仅WRN-rs11574311的等位基因频率在ARC组及对照组之间差异有统计学意义（P=0.003，OR=1.49，95%CI：1.17~1.90），但是经过Bonferroni矫正后，统计学差异消失（P=0.054）。
2.2　对照组和各亚型ARC组SNP频率分布　将ARC患者分为各亚型进行分析，结果显示，BLM-rs1063147可能与核型ARC的发生存在相关性（P=0.03，OR=1.31；见表2），提示稀有等位基因T会增加核型ARC的发生风险。WRN-rs11574311和WRN-rs2725383可能与皮质型ARC的发生存在相关性（P=0.001，OR=1.68；P=0.01，OR=1.49；见表3），提示稀有等位基因C会增加皮质型ARC的发生风险。WRN-rs4733220和WRN-rs2725338可能与混合型ARC的发生存在相关性（P=0.04，OR=0.74；P=0.003，OR=0.60；见表4），提示稀有等位基因A会降低混合型ARC的发生风险。WRN-rs11574311可能与混合型ARC的发生存在相关性（P<0.0001，OR=2.08；见表4），提示稀有等位基因C会增加混合型ARC的发生风险。遗传模型分析提示，在显性遗传模型中，WRN-rs11574311、rs2725383与皮质型ARC，WRN-rs4733220、rs2725338及rs11574311与混合型ARC的发生存在相关性。






2.3　彗星试验分析　彗星试验结果显示：对照组Tail DNA%值为8.64±3.46，OTM值为1.97±1.02，核型ARC中rs1063147携带CC基因型的Tail DNA%值为22.13±2.13，OTM值为6.39±0.93，携带TC+TT基因型的Tail DNA%值为19.57±3.74，OTM值为5.55±1.02；核型ARC组（n=28）外周血淋巴细胞DNA损伤程度显著高于对照组（n=22）外周血淋巴细胞DNA损伤程度（P＜0.001）。皮质型ARC中rs11574311携带TT基因型的Tail DNA%值为22.84±4.25，OTM值为6.66±1.62，携带TC+CC基因型的Tail DNA%值为21.68±1.75，OTM值为6.18±0.88；rs2725383携带GG基因型的Tail DNA%值为22.06±2.87，OTM值为6.40±1.21，携带GC+CC基因型的Tail DNA%值为23.16±4.77，OTM值为6.68±1.78；皮质型ARC组（n=32）外周血淋巴细胞DNA损伤程度显著高于对照组（n=22）外周血淋巴细胞DNA损伤程度（P＜0.001）。混合型ARC中rs4733220携带GG基因型的Tail DNA%值为18.67±2.58，OTM值为5.36±1.04，携带AG+AA基因型的Tail DNA%值为19.07±4.12，OTM值为5.56±1.26；rs2725338携带GG基因型的Tail DNA%值为18.31±2.60，OTM值为5.28±1.03，携带AG+AA基因型的Tail DNA%值为19.55±4.21，OTM值为5.74±1.25；rs11574311携带TT基因型的Tail DNA%值为18.74±2.44，OTM值为5.24±0.88，携带CT+CC基因型的Tail DNA%值为19.01±4.20，OTM值为5.67±1.34；混合型ARC组（n=15）外周血淋巴细胞DNA损伤程度显著高于对照组（n=22）（P＜0.001）。对照组与ARC患者外周血淋巴细胞DNA损伤差异有统计学意义，而不同基因型之间外周血淋巴细胞DNA损伤差异无统计学意义。
3　讨论
    本研究样本均来源于“江苏眼病研究：阜宁县、滨湖区眼病流行病调查”，具有以下几大特点：（1） 该研究样本来源于流行病学人群，避免了医院来源的病例对照研究可能出现的偏倚；（2） ARC分型采取目前国际最先进最准确的分型标准——LOCSⅢ；（3）样本量相对较大且ARC组与对照组定义明确；（4）对照组与ARC组都来源于同一地区且相互之间不存在血缘关系。
    本研究属首次在汉族人群中报道DNA修复基因BLM、WRN和ERCC6多态性与ARC易感性的关系。OGG1 Ser326Cys这一位点已在中国人群中进行了研究，但本研究所检测的两个SNP位点，尚属首次。本研究中所检测的SNP位点可能会改变DNA修复能力，随之产生可能会导致ARC发生的氧化性损伤。氧化应激在人晶状体上皮细胞凋亡过程中起着重要的调节作用，在白内障的发生发展过程中也起着重要作用^［11］。本研究所选定的4个编码DNA修复酶的基因在DSER、NER和BER旁路中发挥了至关重要的作用^［12-14］。
    既往研究^［14］曾报道BLM基因的多态性与结直肠癌、肺癌的易感性相关。本研究结果显示，BLM-rs1063146与核型ARC的发生相关。尽管癌症的发病机制与ARC的发病机制不同，但是老龄化以及基因组的完整与稳定性被破坏在两者发生发展过程中可能都起到一定作用。国内外多项研究^［15-16］已证实WRN基因多态性与年龄相关性疾病存在相关性，包括心肌梗死、2型糖尿病以及肺癌。最近以色列一项研究^［17］报道老年人中白内障的形成与WRN C1367T（rs1346044）多态性位点无关联性。然而，本研究结果显示WRN-rs11574311与皮质型ARC以及混合型ARC存在一定的相关性，WRN-rs2725338与混合型ARC 存在一定的相关性。有趣的是，WRN-rs11574311与WRN-rs1346044之间存在高度的连锁不平衡性。在汉族人群中所做的结果与以色列人群研究结果的不相符可能是由不同种族的遗传异质性以及以色列研究中病例数过少，缺乏足够的样本量这两个原因所引起的。
    既往已有研究^［18-19］证实ERCC6的多态性是AMD发生的危险因素。ARC与AMD均为常见的年龄相关性眼部疾病，这两种年龄相关性眼病可能都受长期的紫外线辐射、氧化损伤、老龄化以及相似的遗传因素等影响。然而本研究结果并未显示ERCC6基因的突变与ARC的发生发展存在相关性。Zhang等^［4］报道OGG1 Ser326Cys这一位点与ARC发生存在相关性。在本研究中所检测了两个位于编码区常见的SNP rs2304277以及rs2072668，并未发现这两个突变位点与ARC相关。
    本研究结果显示，BLM基因与核型ARC相关，WRN基因与皮质型和混合型ARC相关，由于基因的多态性可能改变这两种酶的功能，这种功能性改变则可能会导致不同亚型ARC的发生。因为晶状体核中缺乏细胞核，这种功能性改变可能是由晶状体上皮细胞所产生的。晶状体上皮细胞的异常代谢很容易引起晶状体纤维的功能障碍。利用彗星试验检测外周血淋巴细胞DNA的损伤程度发现，ARC患者DNA的损伤程度远高于与其年龄匹配的对照组。这一结果与Ates等^［20］报道的ARC患者外周血白细胞中8-羟基鸟嘌呤含量升高是一致的，8-羟基鸟嘌呤被公认为是DNA氧化损伤的标记物。然而DNA的损伤程度与突变位点的不同基因型并未发现具有相关性。这一结果表明WRN与BLM基因的突变可能主要作用于眼部晶状体，从而影响ARC的表型，而对外周血中DNA损伤改变不大。
    综上所述，本研究发现在汉族人群中WRN基因的突变可能与ARC的发生发展相关，这种关联性又与不同ARC 亚型有关。这些研究结果强调不同ARC亚型表型的重要性，这可能与这些亚型间不同的危险因素以及发病机制相关。本研究结果将有助于阐明各基因多态性对ARC发生发展影响的相对强度及其作用机制，为将来从分子水平筛选高危人群、设计干预措施提供依据，为ARC的新药开发奠定靶分子的理论基础。