《眼科新进展》  2017年11期 1018-1021   出版日期：2017-11-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
姜黄素对人脉络膜黑色素瘤细胞株血管形成拟态抑制作用及其相关机制的研究


    脉络膜黑色素瘤（choroidal melanoma，CM）是成人眼内最常见的原发性恶性肿瘤，是一种严重危害人类健康的疾病［1］。肿瘤的生长和转移被认为是一个依赖于血管形成的过程。Maniotis等［2］在研究高侵袭性人眼葡萄膜黑色素瘤微循环时发现并提出了一种全新的肿瘤血管形成模式，即血管形成拟态（vasculogenic mimicry，VM），肿瘤细胞通过自身塑形构成的一种功能性微循环管道，可以为肿瘤组织输送血液和营养物质，并有利于肿瘤的侵袭和转移［3］。由于VM 存在，单纯针对内皮细胞的抗血管形成治疗效果往往不理想［4］。这提示在抗肿瘤血管形成治疗中需要兼顾VM 才有可能获得良好的疗效。本课题组在前期实验中发现人CM株OCM-1在体外三维培养中能形成VM［5］。VM形成的分子机制尚不清楚，研究证明［4］，在VM形成过程中存在一条信号传导通路：激活PI3K途径，可以促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和周围基质的重塑，从而最终导致VM形成。
    姜黄素（curcumin；C12H20O6）是一种酚性化合物，具有天然抗肿瘤作用。但其作用机制尚不清楚，一方面姜黄素通过肿瘤的化学预防及抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，达到抗肿瘤作用；另一方面，姜黄素还具有抑制肿瘤血管形成及转移作用［6-7］，主要通过NF-κB、PI3K/AKT抑制肿瘤血管形成［8］；还可以通过下调PI3K/mTOR/ETS2途径，抑制致癌基因MDM2的激活达到抑制肿瘤生长的作用［9］。以上研究可以看出，无论是肿瘤血管形成还是VM的形成，都存在PI3K途径，姜黄素可以通过PI3K/AKT抑制肿瘤血管形成已经得到证实。姜黄素浓度达到30 μmol·L-1时，对OCM-1细胞株VM的形成具有明显的抑制作用［5］。那么有必要探索其作用与PI3K途径的关系。本实验体外三维培养人CM细胞株OCM-1，并初步探讨姜黄素抑制VM形成的机制，为姜黄素抗肿瘤VM的临床应用及其作用机制的深入研究提供一定的实验依据。
1　材料与方法
1.1　主要材料　人CM细胞株OCM-1（瑞典卡洛琳斯卡医学院惠赠）；姜黄素［规格每支1 g，溶于二甲基亚砜（DMSO）中配置成姜黄素溶液（DMSO浓度控制在1 g·L-1以内）］；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；高糖-DMEM培养液（天津斯凯迪商贸发展有限公司）；鼠尾胶原蛋白Ⅰ型（Rat tail tendon collagen TypeⅠ）（生友生物技术有限公司）；PI3K多克隆抗体，EphA2多克隆抗体（Santa Cruz公司）；PV-9000二步法免疫组织化学检测试剂（北京中杉金桥公司）；其他试剂均为国产分析纯。
1.2　OCM-1三维培养模型的建立　参照杭州生友生物技术有限公司鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的使用说明制备三维胶原，取对数生长期OCM-1细胞40×103个·mL-1，接种于24孔培养板内，每孔20×103个细胞。分为5组：姜黄素浓度为0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1组，每组4个平行孔，置于37 ℃、含体积分数5％CO2的培养箱中培养，每隔48 h换液，观察VM形成情况。
1.3　细胞免疫组织化学法检测PI3K、EphA2蛋白的表达　三维培养的OCM-1细胞经处理固定后加入体积分数3％H2O2处理10 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗涤，封闭血清孵育，一抗4 ℃ 反应过夜，二抗37 ℃反应30 min，DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木精对比复染。光学显微镜下观察PI3K、EphA2蛋白的表达情况。结果判定采用综合评分法，根据细胞着色深度及阳性细胞数分别记为0~3分。着色深度以多数细胞呈色程度为准，凡细胞浆着浅棕色者1分，棕色2分，深棕色3分，不着色0分；阳性细胞占所有细胞中的比例＜30%为1分，30%~70%为2分，＞70%为3分，无细胞着色为0分。根据上述两项指标积分数分为4级，0分阴性，2~3分弱阳性，4分阳性，5~6分强阳性。
1.4　统计学方法　应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，数据用x?±s表示，进行单向方差分析，方差齐性检验应用SNK法，多重比较采用LSD法和SNK法，两两比较采用Dunnett法双侧检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　姜黄素对OCM-1细胞EphA2蛋白表达的影响　0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1姜黄素组，EphA2免疫组织化学综合评分分别为（3.800±1.142）分、（2.172±0.718）分、（1.305±0.488）分、（0.570±0.387）分、（0.192±0.093）分，呈浓度依赖性降低，其他各组分别与0 μmol·L-1姜黄素组比较，差异有统计学意义（P=0.000），其中30 μmol·L-1和40 μmol·L-1比较，差异无统计学意义（P=0.300）。EphA2蛋白表达显示（图1）：0 μmol·L-1姜黄素组EphA2染色且围成网格状，棕黄色强阳性；10 μmol·L-1姜黄素组EphA2染色阳性部位为细胞浆，棕黄色，阳性；20 μmol·L-1姜黄素组EphA2染色阳性部位为细胞浆，浅棕色，弱阳性；30 μmol·L-1姜黄素组EphA2染色阴性；40 μmol·L-1姜黄素组EphA2染色阴性。
2.2　姜黄素对OCM-1细胞 PI3K蛋白表达的影响　0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1姜黄素组，EphA2免疫组织化学综合评分分别为（5.580±1.298）分、（2.757±0.985）分、（1.410±0.789）分、（0.263±0.165）分、（0.197±0.082）分，呈浓度依赖性降低，其他各组分别与0 μmol·L-1姜黄素组比较，差异有统计学意义（P=0.000），其中30 μmol·L-1姜黄素组和40 μmol·L-1姜黄素组比较，差异无统计学意义（P=0.188）。PI3K蛋白表达显示（图2）：0 μmol·L-1姜黄素组PI3K染色棕黄色且围成网格状，强阳性；10 μmol·L-1姜黄素组PI3K染色阳性部位为细胞浆，棕黄色，阳性；20 μmol·L-1姜黄素组PI3K染色阳性部位为细胞浆，浅棕色，弱阳性；30 μmol·L-1姜黄素组PI3K染色阴性；40 μmol·L-1姜黄素组PI3K染色阴性。




3　讨论
    CM是成人常见的原发性眼内恶性肿瘤，占全身原发性恶性黑色素瘤 5%～6%［10］，肿瘤细胞主要来源于CM细胞，其特点是肿瘤恶性程度高，易于转移。一旦确诊肿瘤转移，预后极差［1］。目前临床主要以手术治疗为主，辅以放疗及化疗，但疗效各异，迄今为止还没有一种理想的治疗方法。肿瘤的发生、发展及转移均依赖于血管提供必要的营养和氧气，肿瘤血管新生不仅能为肿瘤组织提供足够的营养和氧气，运走代谢废物，以利于肿瘤持续快速生长，而且为瘤细胞进入循环系统向远处转移提供了途径［11］。因此，如果能阻断或抑制肿瘤血管的新生，切断它的营养通路，肿瘤细胞最终将会停止增殖而死亡，达到治疗肿瘤的目的，这就是备受关注的抗肿瘤血管形成疗法［12］。传统意义上的肿瘤血管形成是在宿主已有微血管床上由内皮细胞芽生而产生微血管的过程，但是研究结果发现，单纯以内皮依赖型细胞为靶点的抗肿瘤血管新生疗法对于一些高度恶性的肿瘤疗效欠佳。VM的发现为恶性肿瘤的防治提供了新的思路，为肿瘤治疗开辟了新的靶点。
    抗VM肿瘤的研究目前较为明确的主要信号通路是EphA2与E-钙黏蛋白分子途径。研究表明，EphA2与E-钙黏蛋白是调节VM形成的上游分子，二者共同表达于细胞与细胞间的黏附点，这两种分子之间存在交互作用；而PI3K是EphA2信号转导的中枢分子，激活后可发挥调节多种细胞的功能，如召集多种细胞信号分子，诱导细胞的迁移、存活及管道形成等［13］。PI3K是重要的VM调节因子，活化的PI3K催化二磷酸肌醇磷酸化从而发挥激活细胞信号转导的作用。PI3K通路可激活MMP-14和MMP-2，从而促进LN-5r2水解片段，促进VM的形成［14］。因此，推测PI3K可以作为VM形成通路中信号转导的中枢分子。
    姜黄素抗肿瘤作用机制广泛，其抗肿瘤血管形成的分子机制已得到证实，包括［15-17］：（1）抑制血管内皮细胞增殖并促进其凋亡；（2）抑制血管形成促进因子的表达，包括VEGF、血管形成素-1（Ang-1）、血管形成素-2（Ang-2）等，以及促进血管形成抑制因子——血小板抑制素的表达；（3）降低基质金属蛋白酶的活性；（4）通过磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号途径抑制肿瘤血管形成。同时，从本实验结果来看，在体外三维培养OCM-1细胞过程中，姜黄素呈浓度依赖性（10~30 μmol·L-1）抑制肿瘤VM形成，下调PI3K、EphA2蛋白的表达，姜黄素浓度至30 μmol·L-1 时，几乎全部抑制。因此，从以上研究可以推断，姜黄素可以通过抑制PI3K信号通路同时抑制内皮依赖性血管和VM的形成，以达到抗肿瘤的作用。
    总之，恶性肿瘤是造成人类死亡的主要疾病之一，寻找高效低毒的选择性抗癌药物是恶性肿瘤治疗的必然趋势。临床前试验证明，肿瘤是血管形成依赖性的，所以从抑制肿瘤的血管形成、切断肿瘤细胞的营养供应和转移途径等方面开展的抗肿瘤药物的研究和开发是近年来肿瘤治疗的新手段，也是目前国际上关注的热点。综上所述，CM细胞株OCM-1三维培养研究均已证明，姜黄素可以起到癌化学预防作用和抗癌作用，有可能成为一种极有临床应用价值的肿瘤抑制剂，其机制可能是通过抑制PI3K信号通路同时抑制内皮依赖性血管和VM的形成发挥作用的。