《眼科新进展》  2017年11期 1010-1014   出版日期:2017-11-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
血管内皮生长因子靶向抗体对大鼠角膜碱烧伤后新生血管抑制作用的研究


    血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的促新生血管形成相关因子中最主要的因子之一,它在新生血管发生和发展过程中都发挥着重要作用。研究发现,VEGF在角膜新生血管(corneal neovascularization,CoNV)的形成过程中也发挥重要作用[1]。在碱烧伤诱导的CoNV动物模型中,VEGF和CoNV的发生、发展密切相关[2]。降低VEGF的表达,能够有效抑制CoNV的生长[3]。近10 a来,大量的动物实验和临床研究都已证实通过VEGF靶向治疗CoNV可以取得很好的疗效。我们既往的体外实验已经较全面地评价了VEGF靶向抗体MIL60的生物学特性,MIL60不仅可以与VEGF进行高特异性和亲和力的结合,还能有效抑制VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞的增殖[4]。本研究将进一步探讨结膜下注射MIL60对角膜碱烧伤大鼠模型CoNV的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 军事医学科学院实验动物中心提供的清洁型健康6~8周雄性SD大鼠,体质量100~200 g。实验动物及实验中所使用的各项条件均符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》。
1.2 方法
1.2.1 建立大鼠CoNV模型 所有大鼠均经过眼科裂隙灯显微镜和间接眼底镜检查,排除眼部疾病。以右眼为实验眼;左眼为空白对照眼,不做处理。100 g·L-1 水合氯醛(3.5 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠。奥布卡因滴眼液滴眼3次表面麻醉。开睑器开右眼睑,用棉签去除结膜囊内多余液体。将直径3 mm的圆形Whatman 3号滤纸用10 μL 1 mol·L-1 的NaOH溶液浸泡30 s,然后放置于角膜中央40 s,随即用40 mL 9 g·L-1 NaCl冲洗角膜和结膜囊60 s。处理后可见大鼠角膜中央形成边界清楚的圆形白色烧伤区域。最后结膜囊涂红霉素眼膏预防感染。
1.2.2 造模成功的评定标准 碱烧伤后第1天,裂隙灯显微镜下观察到大鼠的角膜缘血管充盈扩张,中央角膜可见灰白色圆形烧伤区,烧伤区角膜水肿、混浊,隐约可见虹膜,即可确认为中度碱烧伤模型造模成功。如果在实验过程中发生角膜感染或角膜穿孔,则被剔除,及时补充大鼠,重新造模。
1.2.3 动物分组及处理 根据随机数字表法,在碱烧伤后第1天,将72只造模成功的大鼠随机分为4组:MIL60溶剂组、25 mg·mL-1 MIL60组、地塞米松组和NaCl组,分别给予一次性结膜下注射0.05 mL MIL60溶剂、25 mg·mL-1 MIL60、50 mg·mL-1地塞米松和9 g·L-1 NaCl,每组各18只。
1.2.4 CoNV的观察和记录 分别在碱烧伤后第3天、第7天、第14天、第21天和第28天通过裂隙灯显微镜观察并照相,记录大鼠角膜病变进展情况。通过计算机软件进行CoNV的长度和生长面积分析。CoNV生长面积按公式S=C/12×3.14×[r2-(r-l)2]计算。其中C代表角膜新生血管累及角膜的圆周钟点数,r为大鼠角膜半径,l为CoNV从角膜缘生长入角膜的长度。
1.3 标本的取材和处理
1.3.1 组织病理标本的制作与观察 分别在碱烧伤后第3天、第7天、第14天、第21天和第28天每组各处死3只大鼠,取大鼠患眼角膜组织,放置于40 g·L-1 多聚甲醛溶液中固定。取第14天角膜组织行HE染色及免疫组织化学染色。
1.3.2 免疫组织化学染色 对碱烧伤后第14天角膜组织行免疫组织化学染色。VEGF一抗(Santa Cruz,美国),MMP-9一抗、VEGF受体-1(VEGF receptor-1,VEGFR-1;Abcam,美国),VEGFR-2(LifeSpan BioSciences,美国),二抗(EMD Millipore,美国)。免疫组织化学染色结果的判定:VEGF在细胞浆内表达,其阳性反应呈黄色或棕黄色。VEGFR-1、VEGFR-2表达阳性以细胞质或细胞膜中出现棕黄色颗粒为判定标准。基质金属蛋白酶-9 (matrix metallopeptidase-9,MMP-9)以细胞浆和(或)细胞膜中出现棕色或者黄色颗粒为表达阳性。
1.4 统计学分析 使用IBM SPSS(IBM SPSS,芝加哥,IL)软件进行数据统计学分析。实验中的计量资料以均数±标准差(x?±s)表示;多组间数据比较采用完全随机设计资料和随机区组资料的方差分析;多个样本均数间每两个均数比较应用 SNK-q检验。两组比较应用t检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 裂隙灯显微镜观察和软件分析结果 碱烧伤后第1天,裂隙灯下见大鼠右眼结膜混合充血,中央烧伤区的角膜灰白水肿,角膜缘血管网明显扩张,但未见有新生血管生长(图1-2)。分组处理后,在碱烧伤后第3天,裂隙灯下见大鼠角巩膜缘血管扩张较前明显加重,局部可发现新生血管芽自角巩膜缘血管环处长出,已侵入透明角膜,但各处理组的CoNV生长范围并不均匀,血管长度也不相同;与NaCl组和MIL60溶剂组比较,地塞米松组、25 mg·mL-1 MIL60组的CoNV长度和侵入面积明显减少,差异均具有统计学意义(均为P<0.01),但NaCl组和MIL60溶剂组之间、地塞米松组和25 mg·mL-1 MIL60组之间的差异均无统计学意义(均为P>0.05)。碱烧伤后第7天,大鼠CoNV生长迅速,明显变长,且新生血管的顶端分叉更加明显,血管浓密,部分血管交织成网状,已侵入透明角膜的新生血管继续向中央生长延伸,累及角膜的范围变大;各组之间的CoNV密度和管径有明显差异。NaCl组和MIL60溶剂组的CoNV扩张明显,血管浓密且生长较快,累及角膜范围大;25 mg·mL-1 MIL60组的CoNV在形态上明显较地塞米松组生长稀疏,管径较小,而且刚刚开始出现血管顶端的分叉现象;25 mg·mL-1 MIL60组和地塞米松组的CoNV长度和累及面积明显少于NaCl组和MIL60溶剂组(均为P<0.01),NaCl组和MIL60溶剂组之间以及地塞米松组与25 mg·L-1 MIL60组之间CoNV长度和面积差异均无统计学意义(均为P>0.05)。碱烧伤后第14天,裂隙灯下见CoNV呈垂柳状从四周向中心生长,生长速度明显减慢;地塞米松组和25 mg·L-1 MIL60组CoNV长度和累及面积仍明显少于NaCl组和MIL60溶剂组,差异均具有统计学意义(均为P<0.01)。碱烧伤后第21天和第28天,各组仍有部分CoNV继续生长,但生长缓慢,部分原来粗大的CoNV管径开始变细;分别与NaCl组和MIL60溶剂组比较,地塞米松组和25 mg·L-1 MIL60组CoNV长度和累及面积明显减少,差异均具有统计学意义(均为P<0.01),同时,地塞米松组与25 mg·L-1 MIL60组比较,差异亦具有统计学意义(P<0.05;见图1-图3)。



2.2 角膜组织的HE染色结果 碱烧伤后第14天HE染色结果示,NaCl组和MIL60溶剂组大鼠角膜仍有水肿,角膜上皮层增厚,但相对完整;角膜基质层的胶原纤维排列疏松紊乱,角膜上皮层和基质层及内皮细胞层皆可见炎症细胞浸润;角膜上皮下和基质层可见大量新生血管,血管管腔直径较大,管腔内可见成熟红细胞。与NaCl组和MIL60溶剂组比较,地塞米松组和25 mg·mL-1 MIL60组角膜基质新生血管数量明显减少,管径较小(图4)。



2.3 角膜组织的免疫组织化学染色结果
2.3.1 CoNV密度 碱烧伤后第14天免疫组织化学染色结果示,与NaCl组和MIL60溶剂组相比较,地塞米松组和25 mg·mL-1 MIL60组的CoNV密度明显较低(图5)。说明MIL60和地塞米松均能有效抑制CoNV的生长。



2.3.2 各因子蛋白表达 在正常大鼠角膜中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2和MMP-9微量表达或者不表达。碱烧伤后角膜组织中VEGF表达明显增多。碱烧伤后第14天免疫组织化学染色结果示:NaCl组和MIL60溶剂组的角膜全层都可见VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2和MMP-9阳性表达,尤其在角膜基质新生血管附近细胞的细胞浆中和浅基质层附近呈弥漫性强阳性表达。与NaCl组和MIL60溶剂组比较,地塞米松组和25 mg·mL-1 MIL60组上述因子的蛋白表达明显减弱(图6-图9)。



3 讨论
    CoNV的发病机制有多种学说,最主要的有低氧诱导学说、炎症学说和血管形成相关因子失衡学说等[5-7]。其中血管形成相关因子失衡学说是目前研究的热点。CoNV的形成是一个复杂的生物学过程,该过程包括毛细血管内皮下基底膜的降解,内皮细胞增殖、迁移、管状形成和新的血管基底膜的形成等[8],大量的血管形成相关因子、细胞外基质和炎症因子等参与其中。VEGF作为目前研究发现的最重要的促血管形成因子,在CoNV的形成过程中发挥重要作用。本研究主要探讨了VEGF靶向抗体MIL60对碱烧伤诱导的大鼠CoNV的抑制作用。
    通过碱烧伤诱导CoNV形成的动物模型已被广泛应用于CoNV发生机制的研究中。本研究的结果显示,在碱烧伤后第3-7天,大鼠CoNV处于初生期,生长相对缓慢,但第7-14天CoNV的生长速度明显加快,累及的面积也显著增加,并在第21天达到高峰。在碱烧伤后第21-28天,CoNV进入生长晚期,生长速度明显减慢,而且部分CoNV的管径开始变细,尤其是一些小的CoNV开始萎缩,这可能与碱烧伤后不同阶段角膜组织内VEGF的含量发生改变有密切的关系。同时我们还发现,在各个观察时间点25 mg·mL-1 MIL60组的CoNV长度和累及面积均明显小于NaCl组和MIL60溶剂组。免疫组织化学染色结果也证实,碱烧伤后第14天25 mg·mL-1 MIL60组角膜组织中VEGF的蛋白表达水平明显低于上述两个对照组。这与MIL60能与VEGF直接结合,从而降低了游离VEGF的含量,阻止VEGF与血管内皮细胞表面的VEGF受体结合,进而抑制下游信号通路,达到抑制CoNV的形成有密切的关系。
    VEGF的生理学效应是通过与内皮细胞上两个酪氨酸激酶受体VEGFR-2和VEGFR-1高亲和力的结合来实现的。VEGF通过与血管内皮细胞表面的VEGFR-2受体结合激活下游信号,促进新生血管的形成;而目前对于VEGF和VEGFR-1结合后的具体作用尚不是很清楚[9]。有研究发现,VEGFR-1和VEGF的亲和力是VEGF和VEGFR-2亲和力的10倍,曾被认为是抗血管形成因子[10],但近几年研究发现,VEGFR-1具有促血管生长作用,它可以显著促进内皮细胞的迁移和血管形成。Kappas等[11]发现VEGFR-1不仅参与调节VEGFR-2信号通路,并且可以调节血管内皮细胞的定向迁移和血管分叉的形成。还有研究发现VEGFR-1可能是通过激活PLCγ和PI3K的酪氨酸磷酸化来放大VEGF引起的促血管形成反应[12]。Lee等[13]发现PTK7可能在VEGFR-1引起的促血管形成信号传递过程中发挥重要作用。本研究中我们发现,VEGFR-1和VEGFR-2与VEGF的表达具有很强的一致性,这也证实了VEGF的两种受体在血管发育过程中及血管通透性的调节中发挥着协调作用[14-15]。同时我们还发现,MIL60不仅能显著抑制CoNV生成过程中VEGF蛋白的表达,还能抑制VEGFR-1和VEGFR-2蛋白的表达。免疫组织化学的结果表明,VEGFR-1、VEGFR-2和VEGF蛋白表达的部位基本一致。碱烧伤后第14天,25 mg·mL-1 MIL60组的VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2蛋白表达均显著低于对照组。这说明MIL60不仅能中和VEGF,而且还能下调VEGFR的表达,从而进一步降低VEGF与VEGFR结合反应的发生,减少VEGF和VEGFR结合后信号转导和效应蛋白的合成,最终抑制CoNV的形成。
    在CoNV的形成过程中,除了内皮细胞增殖,其他重要的步骤是细胞外基质和基底膜的降解,以及管状形成后基底膜的二次形成。在新生血管形成过程中,内皮细胞要穿过细胞外基质和基质外纤维支架,而细胞外基质的降解要依赖纤溶酶原-纤溶酶系统、组织蛋白酶和MMPs等的作用,其中MMPs发挥主要作用。MMPs是肽链内切酶家族,可以由多种细胞分泌;激活的MMPs能对细胞外基质中不同分子结构的成分进行降解。MMPs常以无活性酶原形式存在于正常角膜组织中,在化学、物理和各种不同病理情况下MMPs均可以被激活。发生角膜病变的过程中,角膜细胞分泌的蛋白水解酶中有95%以上是MMPs[16]。通常情况下,组织内的MMPs及其抑制剂能够保持相对平衡状态,但在病理状态下,如CoNV形成过程中,细胞外基质被过度破坏,该平衡就被打破,MMPs表达增加,从而发挥重要作用[17]。MMP-9作为参与调节CoNV形成过程中的主要因子之一,其通过调节角膜细胞外基质来影响细胞和细胞之间、细胞和基质之间的信号传递,从而调节细胞分化、黏附、迁移、损伤修复和组织重塑,促进CoNV的生成。Cejka等[18]在间充质干细胞治疗兔角膜碱烧伤的研究中发现,干细胞可以有效降低MMP-9和VEGF的表达,二者表达存在一定协同性。同时,MMP-9与VEGF之间也存在协同作用,即MMP-9能促进VEGF的释放,而VEGF也能促进血管内皮细胞分泌MMP-9[19-21]。借助活化巨噬细胞来诱导CoNV生成的研究中发现VEGF和MMP-9均明显上调[13]。将成纤维细胞生长因子-2缓释药片植入鼠板层角膜诱发CoNV的研究中,不仅发现MMP-9的表达增加,而且MMP-9的增加程度与新生血管的生长程度一致。抑制MMP-9的活性,可以减小MMP-9降解细胞外基质的作用从而降低新生血管的发生率[22]。在本研究中,我们发现碱烧伤后第3天MMP-9表达最强,给予MIL60治疗后MMP-9的表达水平明显低于对照组。
    综上所述,本研究证实MIL60能有效抑制角膜碱烧伤后CoNV的形成并减轻炎症反应。其早期的抗CoNV形成效果和抗炎作用与地塞米松相当,有望成为抗CoNV治疗过程中的一种新的选择。但最佳的给药途径和给药剂量等问题仍有待于进一步研究。