《眼科新进展》  2017年11期 1005-1009   出版日期：2017-11-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
超声造影对兔眼脉络膜黑色素瘤血流循环的定量评估


    脉络膜黑色素瘤居成年人眼内肿瘤发生率第一位，可严重影响患者的视力，甚至威胁患者生命［1-2］。目前，脉络膜黑色素瘤的诊断依赖眼底血管造影、超声、CT、MRI等，但均存在不足，如荧光造影缺乏矢状面及立体的血流充盈信息等［3］。超声造影是通过静脉注入超声微泡，其在超声波下发出谐波，使得造影剂与血管内体液声阻抗存在明显差异，显著增强病变区组织血流循环显影［4］。超声造影能够定性判断肿块矢状面上的肿瘤组织血流充盈模式，但是对于眼内肿块组织血流量、血流速度等血流循环模式的判断尚缺乏客观的定量研究。此外，与人脉络膜黑色素瘤生物学行为相似、制作简便、成功率高且稳定的动物原位模型的建立能够为新诊断、治疗方法的研究和应用提供基础［5-6］。有文献报道，B16F10异种移植瘤模型，但对该动物模型的眼内肿瘤生长特点、血流循环模式等评价仍缺乏相关研究［7-10］。因此，本研究一方面探索建立兔眼脉络膜黑色素瘤模型的改良方法，以期获得稳定的、成瘤率高兔眼原位肿瘤模型；另一方面通过超声造影技术，定性和定量分析肿块血流灌注参数特点。
1　材料与方法
1.1　材料　脉络膜黑色素瘤细胞株B16F10，购于中国科学院细胞库（上海市）；实验动物C57BL小鼠5只，新西兰大白兔10只，由上海市第一人民医院动物实验中心提供，雌雄随机选取；共聚焦扫描激光显微镜（HRA，Herdelberg Engineering，Carlsbad/Ca），超声微泡声诺维（Bracco Imaging B.V.），高分辨率超声仪 （Iu Elite，FHILIPS）等。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　脉络膜黑色素瘤细胞株B16F10，待细胞近铺满培养瓶底时用胰蛋白酶消化细胞，将细胞接种于大培养皿，培养基为DMEM（Gibco），内含有100 μg·mL-1小牛血清，置于37 ℃、含体积分数5％CO2培养箱中，每天观察肿瘤细胞生长情况，2 d更换培养基一次。5 d左右传代，待细胞长满培养皿底后，用胰蛋白酶消化，无菌PBS冲洗3次，收集细胞，1080 r·min-1离心3 min，弃去上清液，用不含小牛血清的培养基DMEM配成100×106个·mL-1细胞悬液，准备肿瘤皮下种植。
1.2.2　小鼠皮下肿瘤种植、肿瘤碎片制备　C57BL小鼠5只，雄性，鼠龄4~6周，固定后剪去右侧大腿内侧被毛暴露皮肤，酒精消毒皮肤，用1 mL注射器抽取0.1 mL混匀的肿瘤细胞悬液，注入皮下可见色素性皮丘，缓慢退针并按压进针部位以防止细胞外溢。隔天观察小鼠肿瘤生长情况。待2周小鼠皮下肿瘤生长至直径1.5 cm左右，断颈处死小鼠后剪开肿瘤部位皮肤，将肿块完整剥除，取肿瘤组织边缘处较紧密瘤组织，剪成大致均匀2 mm×2 mm×2 mm小组织块，放入无菌生理盐水中备用。
1.2.3　兔眼肿瘤种植　新西兰大白兔10只，体质量2.2~2.5 kg，雄性，从肿瘤种植1 d前至实验结束每天肌肉注射环孢素A （山地明）15 mg·kg-1进行兔免疫抑制。静脉注射10 g·L-1戊巴比妥钠3 mL·kg-1麻醉动物，开睑器开睑后眼球表面滴表面麻醉剂盐酸奥布卡因滴眼液（4 mg·mL-1），做3点、9点钟位牵引缝线使眼球向下翻转，在鼻上方平行角巩膜缘剪开球结膜，在距角巩膜缘后方3 mm平行于角巩膜缘小心切开巩膜深度3/4，做长约3 mm切口，用1 mL注射器前方穿刺放出少量房水适当降低眼压，用巩膜剪小心剪开巩膜内层暴露脉络膜，用虹膜恢复器钝性分离脉络膜上腔，无齿镊夹取一块肿瘤组织于切口处，使用虹膜恢复器向后下方将肿瘤组织推入脉络膜上腔并尽量推向眼球后极部，对侧眼剪取同样大小结膜组织，以相同的方法种植入脉络膜上腔，8-0可吸收缝线逐层缝合巩膜、结膜，生理盐水冲洗，氧氟沙星眼膏涂眼。每周观察兔眼内肿瘤生长情况，兔免疫抑制不良反应如呕吐、腹泻、体质量下降等。
1.2.4　超声造影　动物肿瘤种植3周后，超声微泡声诺维（Bracco Imaging B.V.）根据使用说明向小瓶内注入5 mL无菌生理盐水，轻柔振荡20 s制成均一、乳白色液体备用。眼球表面局部麻醉，常规灰阶超声下观察肿瘤形态、大小、内部回声、范围等，彩色多普勒超声下观察肿瘤内部血流信号分布、血流方向等。超声造影采用双幅模式同步记录，定位肿瘤后选取肿瘤最大面积切面，调整超声增益使肿瘤清晰显影，超声探头保持不动，经兔耳缘静脉团注入0.6 mL超声微泡造影剂，同时开始超声图像连续记录，观察直至造影剂完全消退。造影完成后，由经验丰富超声医师、眼科医师采用软件SonoLiver分析肿瘤时间——强度曲线及相关数据，选取种植肿瘤眼球的正常眼球壁作为对照组织进行分析［11-12］。
1.3　统计学处理　本研究采用SPSS 21.0软件进行统计学处理，计量资料数据采用均数±标准差描述，ANOVA单因素分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　脉络膜黑色素瘤细胞株B16F10培养和小鼠皮下肿瘤种植　脉络膜黑色素瘤细胞株B16F10细胞培养贴壁生长，表现为上皮样细胞，胞核大、病理性核分裂象位于细胞中央，细胞质内可见黑色素团块状，部分分泌至细胞外，培养基中可见到黑色颗粒样物质（图1）。C57BL小鼠皮下成瘤率100%，1周时可见右侧大腿内侧饱满；2周时肿瘤球形、膨胀性生长，凸向体外，完整剥除的肿瘤块被致密包膜包裹，肿瘤质软，内部大量黑色、糊状无定形肿瘤坏死组织，仅肿瘤皮质近边界处组织稍致密（图2）。
2.2　兔眼内肿瘤组织碎片植入及眼内肿瘤生长情况　直接检眼镜下观察兔眼，种植后1周可见种植部位扁平黑色区域，为种植肿瘤组织，未凸向玻璃体腔，未见明显眼底出血、白内障等并发症；种植后2周可见黑色肿瘤组织眼底浸润范围扩大，肿瘤轻度凸向玻璃体腔，2只动物于2周末死亡，拒食、腹泻等药物副作用导致可能性大；种植后3周，肿瘤明显进行性增大，透过瞳孔有肉眼可见黑色眼底反光，兔眼成瘤率为80.0%。
2.3　灰阶超声、多普勒超声下眼内脉络膜黑色素瘤特点　肿瘤种植3周后，普通超声下观察，可见肿瘤大小为（0.99±0.32）cm，表现为眼内球形肿块，基底部大小不一、向玻璃体内蘑菇样生长，肿块基底部与眼球壁边界欠清晰，内部回声不均一，合并点状高回声、斑片状低回声区域（图3）；对侧眼内未见肿块生长，眼球壁光滑，回声均匀。彩色多普勒超声下可见肿块血液供应丰富、不均一，可检测到动脉波形血管（图4）。
2.4　超声造影下眼内脉络膜黑色素瘤特点　超声造影中，肿瘤后极部血管首先充盈，肿瘤内血流信号非匀质，充盈模式有多种，有从基底部向肿瘤内部充盈、有从肿瘤周边部向肿瘤内部充盈、有从基底部及肿瘤内部中心向周边组织充盈等，点状充盈缺损与普通超声钙化灶相对应，片状低充盈区与普通超声中片状坏死灶相对应。最大切面两条垂直线测量值为（0.92±0.28）cm、（0.66±0.30）cm，内部回声非均质，存在钙化灶、坏死灶。超声造影图像分析，峰值强度为（263.56±143.33）%，上升时间为（5.01±1.42）s，达峰时间为（6.17±2.18）s，渡越时间为（18.01±7.65）s，曲线下面积为（4505.13±1491.75）%，上升支斜率为59.48±75.18，下降支斜率为-7.21±5.76。肿瘤组织与正常眼球壁组织比较，峰值强度、曲线下面积、下降支斜率较大，差异均有统计学意义（均为P<0.05），上升时间、上升支斜率、达峰时间、平均渡越时间差异均无统计学意义（均为P>0.05；见表1）。







3　讨论
    目前国内外文献报道多种眼内原位脉络膜黑色素瘤动物模型的制作，如模型肿瘤细胞可来源于鼠皮肤黑色素瘤细胞B16F10、人脉络膜黑色素瘤细胞92.1或OCM1，使用不同动物宿主包括C57BL小鼠、裸鼠、兔等［6，11-12］，但均存在局限性。首先，模型制作中所用器械要求高，普遍适用性低。周金琼等［6］制作兔眼脉络膜黑色素瘤B16F10模型成功率95%，研究者使用接有18号自制针头注射器，将肿瘤组织推送至眼球后极部，可能较镊子夹取方便固定组织，但其存在缺陷，如自制针头特点未予以阐述可能使得方法推广受限、吸入针头内部肿瘤组织碎片情况难把握、针头内部消毒彻底难度稍大［6］。其次，肿瘤模型成瘤率差异较大、稳定性差。Bonicel等［13］将人脉络膜肿瘤碎片种植入脉络膜上腔，仅25%眼内原位成瘤，远低于脉络膜黑色素瘤细胞株B16F10兔眼肿瘤种植成功率，猜想可能与细胞种属来源、肿瘤细胞侵袭特性相关。但Mueller等［13］和Kang等［12］报道，92.1细胞株来源肿瘤组织眼内原位种植，成瘤率最高达83%［3，12］。因此，脉络膜肿瘤原位肿瘤模型尚缺乏可靠的公认动物模型标准。本研究通过组织碎片原位种植改良方法成功制作兔眼脉络膜黑色素瘤模型。本实验中兔眼3周肿瘤成瘤率达80.0%，可能实验相关改良操作降低了肿瘤组织种植难度，同时增加了成瘤可能性。首先，实验选择肿瘤组织块种植，而非肿瘤细胞脉络膜下腔注射，细胞注射需要特殊眼底显微镜下操作，仪器要求高，操作难度大。其次，本研究选择做稍大巩膜切口，长约3.0 mm，无齿镊夹取组织块配合虹膜恢复器，将肿瘤组织推送至眼球后极部，手术器械要求低，植入肿瘤组织块稍大。另外，在突破巩膜内层进入脉络膜上腔前，1 mL注射器行前房穿刺，放少量房水可一定程度降低眼压，使脉络膜易与巩膜分离，而减少损伤脉络膜的可能。但需注意前房穿刺勿损伤虹膜和晶状体，且不可过度抽取房水降低眼压，否则可能增加脉络膜出血倾向。
    超声造影检测脉络膜黑色素瘤血液循环水平较普通超声、多普勒超声可以更多地为临床诊断和进一步治疗提供重要依据。首先，本研究发现造影剂注射后眼球充盈模型多样，可为肿块从基底部向周围充盈、或者肿瘤中心最早充盈，而后造影剂逐渐向周边充盈；推测与肿瘤内部血管供应、血流运动方向相关，血管管径粗大、与眼球壁脉络膜血管网直接供应的肿瘤组织充盈时间早。其次，超声微泡在肿瘤中表现为非匀质充盈，而且低充盈区域与钙化灶、坏死灶相对应。刘海芸等［5］回顾性研究2008年至2014年发现眼内占位病变患者40例，发现眼内占位超声造影中有三种类型——富含血供、少血供、乏血供，并且结果与吲哚青绿检测眼内肿块血管供应有较高的一致性（75%）［5］。本研究发现超声造影下肿块血液灌注可能与肿瘤内部组织性质及结构相关，超声造影与普通灰阶图像、多普勒超声在异常回声信号的现象中并非完全对应：普通超声易受肿块性质、体积、深度等因素影响，肿块深部因声影、回声衰减明显等原因导致显像存在误差，且普通超声无法提供组织血流信息；多普勒超声能在一定程度上提供肿块血供信息，但对于肿块内血流速度慢、管径细小的血管，其无法提供有效信息。超声造影在两者的基础上对于病变区、病变内异常的高、低回声组织的判断提供了组织内的血流信息，因此可以提高临床判断的准确性。
    本研究利用超声造影定量分析眼内肿瘤血液循环特征，并首次将曲线下面积和血液灌注升、降支斜率用于眼内肿瘤血流循环的评估。本研究发现并证实，眼内肿瘤组织充盈与正常眼球壁组织相比，充盈峰值强度、曲线下面积较正常眼球壁组织高，差异均有统计学意义。正常眼球壁中视网膜、脉络膜血管供应丰富，但推断肿瘤组织血供更加丰富。可能与肿瘤内部新生的异常血管数量、管径大小、循环模式异常相关，如肿瘤内部可能广泛存在的动-静脉循环短路、血管拟态等，但尚未被证实［14］。杨文利等［15］研究了21只脉络膜黑色素患眼超声造影显影特点，发现肿瘤组织与眼眶内组织相比，造影剂充盈峰值强度高。但其为回顾性研究，未对肿瘤内部血液灌注曲线下面积等参数采集分析，且纳入分析的患者缺乏临床病理学诊断数据。曲线下面积可反映肿瘤内循环血量，与另一血流量检测指标——最大峰值强度相比，此参数受被检测者个体差异影响小，数据相对稳定、可靠。因此，超声造影中量化检测指标的综合应用和分析是准确判断病变区血流循环状况的基础。
    本研究发现，肿瘤组织在上升时间、达峰时间、平均渡越时间、上升支斜率上与正常眼球壁存在差异，但是均无统计学意义（均为P>0.05）；下降支斜率较正常眼球壁大，差异有统计学意义。本研究推断，兔眼脉络膜黑色素瘤与正常眼球壁相比，造影剂进入组织的血流充盈速度无明显差异，但肿瘤组织内造影剂消退明显快于眼球壁，即以眼球壁为参考，通过量化指标反映眼内肿瘤血液循环模式为“正常进入快速消退”的特征，与人眼内肿瘤超声造影量化结果一致。另一方面，肿瘤组织造影剂充盈的渡越时间短于正常眼球壁组织，提示肿块内血液流动速度较正常眼球壁快，但差异无统计学意义（P=0.11），猜测可能与样本量较小有关。杨文利等［15］在人眼肿瘤的研究中，发现肿瘤血流的平均渡越时间显著短于眼眶内组织。但眼球壁血流供应丰富，与眼眶内组织血流供应明显不同，因此，人眼内肿瘤与正常眼球壁血流充盈速度是否存在差异尚不明确。因此，眼内肿瘤血流灌注速度、充盈时间等的量化特点及其与眼球壁血流循环是否存在差异，尚待进一步扩大样本量研究。
    本研究将脉络膜黑色素瘤的瘤组织碎片，经巩膜切口植入兔眼脉络膜上腔，成功制作兔眼原位脉络膜黑色素瘤动物模型，其操作方法、器械要求简单、可重复、稳定性好，可为脉络膜黑色素瘤的研究提供基础。经静脉团注超声微泡后，超声造影在肿瘤中表现为非匀质充盈，低充盈区域与肿瘤内部钙化灶、坏死灶相对应。眼内肿瘤组织充盈与正常组织相比，肿瘤充盈峰值强度、曲线下面积较正常眼球壁组织高，充盈消退快，提示肿瘤内血液循环量、血流速度较正常眼球壁大。因此，超声造影是一种定量评估眼内脉络膜黑色素瘤血流循环模式的有效方式，可为临床医师在脉络膜黑色素瘤诊断、抗肿瘤血管治疗及疗效评估上提供一定依据，但其进一步的研究和应用仍需大量临床数据支撑。
    本研究尚存在不足之处，如样本量较小；实验仅研究鼠皮肤黑色素瘤来源异种眼内肿瘤模型超声造影特征，但其与人脉络膜黑色素瘤来源眼内肿瘤在超声造影、肿瘤血流供应模式等方面是否存在差异尚需进一步研究。