《眼科新进展》  2017年8期 759-763   出版日期：2017-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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结膜松弛症患者泪膜稳定性、杯状细胞及黏蛋白5AC表达的变化


    结膜松弛症是老年性常见眼病，随着人口老龄化加快，患者日趋增多。主要表现为球结膜过度松弛和（或）下睑缘张力高，松弛球结膜堆积在眼球与下睑缘以及内、外眦部之间形成皱褶，引起眼表泪液学异常，并伴有眼部干涩、异物感、溢泪不适等症状^［1-2］。眼表黏蛋白对维持泪膜的稳定和眼表上皮细胞的正常生理功能至关重要。来源于结膜杯状细胞的黏蛋白5AC是泪膜中含量最多的黏蛋白，凭借其高亲水特性与泪液中的水分形成水合凝胶状态，维持泪膜的稳定并防止眼表上皮干燥^［3］。本研究通过检测和观察结膜松弛症患者泪膜稳定性、杯状细胞变化及黏蛋白5AC的表达情况，探讨结膜松弛症的发病机制。
1　资料与方法
1.1　资料
1.1.1　一般资料　2013年9月至2015年7月在我院就诊的结膜松弛症患者30例（30眼），男11例，女19例，年龄63~78岁，平均71.5岁。结膜松弛症分级^［1］：Ⅱ级9眼，Ⅲ级17眼，Ⅳ级4眼。另选取单纯老年性白内障手术患者15例（15眼）为正常对照组，男6例，女9例，年龄65~80岁，平均72.6岁。
1.1.2　结膜松弛症组患者选择标准　按结膜松弛症诊断标准^［1］确定病例；结膜松弛症分级≥Ⅱ级，经规范药物等保守方法治疗3个月无效者为手术适应证，患者知情同意后开展手术治疗；角膜、泪腺及泪点正常；泪道冲洗通畅，无阻塞鼻泪管的病变；睑缘无内、外翻及倒睫；无影响泪液学异常的其他眼病及全身性疾病；无眼部手术史，3个月内未应用影响泪液分泌的药物。
1.1.3　正常对照组患者选择标准　随机选择单纯老年性白内障超声乳化手术的病例，无眼部其他不适主诉，裂隙灯检查眼表形态结构无异常，无结膜松弛症，年龄与结膜松弛症组患者匹配，患者知情同意签字后确定为正常对照组^［4］。
1.1.4　试验材料及仪器　裂隙灯（苏州医疗器械厂），自吸式毛细玻管（国药集团化学试剂有限公司），显微镜载玻片及盖玻片（上海机械进出口公司），荧光素试纸条、Schirmer Ⅰ试验（Schirmer Ⅰ test，S Ⅰ t）试纸(天津晶明新技术开发有限公司)，兔黏蛋白5AC单克隆抗体(1∶200，美国Sigma公司)，羊抗兔二抗(北京中衫金桥公司)，Olympus BX51双目光学显微镜，HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统（美国Leica公司）。
1.2　方法
1.2.1　标本的采集与制备　结膜松弛症组患者术中切除的松弛结膜，正常对照组患者在白内障手术中剪取相应区域的球结膜组织（与结膜松弛症切除的解剖部位相一致），上皮面朝上，基质面朝下，平铺于无菌滤纸上，标本经体积分数40%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，分别行HE染色、AB染色、黏蛋白5AC免疫组织化学染色。
1.2.2　眼部症状评分　采用国际眼表面疾病指数(ocular surface disease index，OSDI)积分法^［5］对患者进行眼部症状问卷调查，症状包括：(1)眼干涩，(2)眼异物感，(3)溢泪，(4)视物模糊，(5)视疲劳，(6)眼疼痛，(7)眼痒，(8)眼红，(9)畏光。每项积分按症状持续时间计算，全部时间为4分，大部分时间为3分，一半时间为2分，小部分时间为1分，从未出现症状为0分。症状积分计算公式为：以上总积分数×25／答题数，总分为100分^［6］。
1.2.3　泪膜破裂时间检测　泪膜破裂时间（tear break-up time，BUT）：用蒸馏水1滴湿润荧光素试纸条，轻触下睑结膜囊外侧，嘱其瞬目3次使得荧光素均匀分布于眼表后维持眼睑张开，裂隙灯下用钴蓝光观察，记录从最后一次瞬目到角膜表面出现第一个黑斑的时间。重复3次，取其平均值。
1.2.4　S Ⅰ t检测　在自然状态下，将S Ⅰ t试纸置入结膜囊的中、外三分之一交界处，5 min后取出试纸，测量湿长。重复2次，取其平均值。
1.2.5　泪液羊齿状结晶试验　泪液羊齿状结晶试验（tear ferning test，TFT）:取10 μL的玻璃毛细管在下睑结膜囊泪阜处通过虹吸方法吸取泪液标本（未使用表面麻醉药物或其他化学性药物），尽量不接触眼表。将泪液标本吹入载玻片，在25 ℃室温下干燥10～20 min，置于双目光学显微镜下观察泪液羊齿状结晶并评级：其中Ⅰ级和Ⅱ级均为正常，Ⅲ级和Ⅳ级为异常^［7］。
1.2.6　结膜组织黏蛋白5AC免疫组织化学染色　石蜡切片烘干、脱蜡，经胰蛋白酶消化、双氧水消除内源性过氧化物酶活性、山羊血清封闭后，依次使用来源于兔黏蛋白5AC单克隆抗体于4 ℃冰箱内反应过夜，羊抗兔二抗室温反应1 h，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，脱水，透明，封片，光镜下观察。染色结果判定：细胞膜边界清晰、无特异性细胞胞质染色者为阴性，细胞胞质呈浅棕黄色者为弱阳性，细胞胞质呈棕色者为中度阳性，细胞胞质呈深棕色者为强阳性。
1.3　统计学方法　应用SPSS 17.0统计软件对所有数据进行统计学处理。OSDI、BUT和S Ⅰ t评分比较，采用两样本均数t检验；黏蛋白5AC免疫组织化学染色、TFT结果比较，采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　眼部症状及体征评估　结膜松弛症组OSDI评分比正常对照组明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。结膜松弛症组BUT比正常对照组明显缩短，差异有统计学意义(P<0.01)。S Ⅰ t结膜松弛症组较正常对照组明显减少，差异亦有统计学意义(P<0.01，见表1)。



2.2　TFT检测结果　结膜松弛症组患者泪液中羊齿状结晶明显减少，羊齿状结晶正常（Ⅰ级和Ⅱ级）仅占40.00%（12/30），Ⅲ级最多占到53.33%（16/30），Ⅳ级占6.67%（2/30）。而正常对照组羊齿状结晶正常（Ⅰ级和Ⅱ级）占93.33%（14/15），Ⅲ级仅占到6.67%（1/15），未发现Ⅳ级羊齿状结晶病例；两组比较差异有统计学意义（χ2=14.309，P=0.003，图1A-2A）。
2.3　HE染色结果　光镜下结膜松弛症组表现为球结膜整体厚度变薄；鳞状上皮增生明显，表面角化不全，厚薄不均；固有层明显变薄，结构疏松，胶原纤维少，弹力纤维缺失。部分病例可见上皮下水肿；固有层间质淤血水肿，血管周围片状出血，出现淋巴细胞、浆细胞浸润（图1B）。而正常对照组球结膜整体厚度较厚，胶原纤维及弹力纤维均匀分布(图2B)。
2.4　AB染色结果　AB染色杯状细胞呈蓝色。结膜松弛症组杯状细胞数较正常对照组明显减少，形态无明显变化，细胞有向表面迁移的趋势。细胞核扁平，被大量黏液推挤于细胞底部，固有层结缔组织疏松、很薄，血管扩张淤血，少数淋巴细胞、浆细胞灶性浸润（图1C）。正常对照组球结膜上皮层中杯状细胞大小、形态与结膜松弛症组相似，数量相对较多（图2C）。
2.5　黏蛋白5AC免疫组织化学染色结果　结膜松弛症组结膜上皮细胞中黏蛋白5AC阳性细胞数较正常对照组明显减少，差异有统计学意义(χ2=9.499，P=0.023；见表2，图1D-2D）。





3　讨论
    结膜松弛症是以眼表泪液学异常为特征的老年性常见眼病，1999年张兴儒等^［8］在国内首次报道了结膜松弛致溢泪的临床病例。MIMURA等^［9］对1416例1~94岁患者进行调查发现，结膜松弛症患病率为85.24%。国内，ZHANG等^［10］对上海市曹杨新村街道年龄≥60岁2225名老年人进行流行病学调查发现结膜松弛症患病率为44.08%。傅东红等^［11］对无锡市滨湖区50岁及以上人群进行流行病学调查发现结膜松弛症患病率为13.92%。
    泪膜稳定是维持眼表健康的基础，任何原因引起泪液组成成分的改变都会引起泪膜的不稳定，从而导致临床症状产生。根据OSDI评分结果，结膜松弛症组患者出现眼干涩、异物感、溢泪、视物模糊、视疲劳等症状的发生率明显高于正常对照组(P<0.01)，这在本研究和既往的研究^［10］中均得以证实。那么究竟是哪些原因引起结膜松弛症患者眼表不适症状呢？由于泪液的蛋白质组成中黏蛋白是维系泪膜稳定的重要蛋白，它的含量改变会引起泪膜不稳定^［12］。本研究证实结膜松弛症组BUT、S Ⅰ t试验均明显短于正常对照组(均为P<0.01)。其后通过HE染色、AB染色和黏蛋白5AC免疫组织化学染色研究显示结膜松弛症患者杯状细胞减少，结膜变薄，鳞状上皮增生，固有层变薄，胶原纤维少，弹力纤维缺失。同时固有层间质出现淤血水肿，炎症细胞浸润，黏蛋白5AC免疫组织化学染色阳性细胞明显低于正常对照组(P=0.023)。
    目前发现存在于眼表的黏蛋白有7种，分别为黏蛋白1、黏蛋白2、黏蛋白4、黏蛋白5AC、黏蛋白5 B、黏蛋白7、黏蛋白16。分泌型黏蛋白5AC是泪膜中的主要黏蛋白，由结膜杯状细胞分泌，对稳定泪膜、保护眼表、参与信号转导、维持眼表功能等起着重要作用。当各种内、外源性因素引起杯状细胞数量或分泌功能改变时，黏蛋白数量和质量将发生异常^［12-13］。ZHAO等^［14］研究发现结膜松弛症患者结膜杯状细胞的组织病理学及超微结构发生改变，且随着病变程度加重，杯状细胞密度降低显著，导致黏蛋白分泌减少。王晓春等^［15］也发现杯状细胞的变化与结膜松弛病情变化相平行。流式细胞术证实黏蛋白5AC阳性的杯状细胞比例在干眼症患者中有所下降^［16］。另有研究发现Sjgren综合征患者泪液中，黏蛋白5AC及其mRNA的表达水平与正常人相比均显著下降^［17］。ZHANG等^［18］发现黏蛋白5AC的表达与BUT呈显著正相关，同时发现轻度干眼与重度干眼相比，重度者黏蛋白5AC的分泌量显著降低。本研究结果显示结膜松弛症松弛结膜组织中杯状细胞减少，泪液羊齿状结晶减少，同时黏蛋白5AC阳性表达细胞明显低于正常对照组。由于泪液中羊齿状结晶减少间接反映了泪液中黏蛋白含量减少^［7］，黏蛋白5AC分泌的减少可能直接导致了结膜松弛症泪膜稳定性下降，并最终导致眼表的不适症状。
    本研究从不同角度证实结膜松弛症患者黏蛋白异常，特别是松弛结膜组织中黏蛋白5AC表达的改变可能导致泪膜不稳定、泪液渗透压增高、激活炎症反应、眼表损伤、上皮细胞凋亡、杯状细胞数下降，而这些病理改变又可诱导黏蛋白进一步改变，继而形成一个黏蛋白与结膜松弛症的恶性循环，最终患者出现球结膜过度松弛、眼表泪液学异常，眼部干涩，溢泪等症状。我们分析原因如下：(1)眼表炎症反应：结膜松弛症与炎性因子息息相关^［19］，眼表炎症反应能引起杯状细胞凋亡，本研究发现结膜松弛症松弛结膜上皮下炎症细胞浸润明显，可能导致了杯状细胞减少，继而分泌黏蛋白5AC减少。(2)泪液渗透压增高：结膜松弛出现泪液渗透压增高，并可激活一系列的炎症反应造成眼表上皮的破坏，这些破坏包括细胞凋亡、杯状细胞减少以及黏蛋白的改变，从而引起泪膜不稳定，反过来加剧泪液渗透压的升高，形成恶性循环^［20］。(3)黏蛋白糖基化减少：IMBERT等^［21］发现黏蛋白糖基化是对抗干眼的重要机制，如没有糖基化则黏蛋白将缺乏黏弹性能，进而丧失功能。杯状细胞可表达ppGaNTase亚型以启动黏蛋白5AC O-糖基化，故杯状细胞的减少进一步加剧了黏蛋白5AC糖基化的减少并出现眼表的不适症状。
    因此黏蛋白5AC的改变，包括量的减少和质的改变，是结膜松弛症发病中的中间环节，同时也是结膜松弛症的结果之一。究竟是何上游通道导致结膜杯状细胞和黏蛋白5AC分泌减少，还需要进一步实验研究证实。