《眼科新进展》  2017年8期 723-727   出版日期：2017-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

---

阈值下577 nm微脉冲激光光凝对早期糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子、神经生长因子和趋化素表达的影响


    大量临床研究已证实，阈值下微脉冲半导体激光光凝可有效治疗糖尿病性黄斑水肿、视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿及年龄相关性黄斑变性等疾病^［1-3］。它通过选择性作用于视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞引起相关蛋白的分泌与释放,从而达到治疗疾病的目的。目前常用的阈值下微脉冲激光有810 nm和577 nm两种，577 nm纯黄光激光对视网膜光凝来说是最安全、有效的^［4］，且具有先进的多点快速扫描新技术，故本研究采用该激光器的微脉冲模式，通过对成年Brown Norway (BN)大鼠进行视网膜光凝，探究阈值下577 nm微脉冲激光光凝对血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、趋化素（Chemerin）mRNA和蛋白表达的影响，进一步揭示其治疗视网膜血管疾病的机制。
1　材料与方法
1.1　动物模型的建立　取北京维通利华实验动物技术有限公司提供的健康成年BN大鼠40只，鼠龄6～8周，雄性。饲养方法遵从视觉与眼科学研究协会关于眼科和视觉研究饲养和使用动物标准。所有大鼠屈光间质清晰，眼底检查无异常。大鼠空腹24 h后,每只给予链脲佐菌素65 mg·kg^-1单次腹腔注射破坏其胰岛细胞。链脲佐菌素用0.1 mmol·mL^-1柠檬酸缓冲液（pH 4.4）稀释成体积分数2%的溶液注射。给药后24 h及1周内以尾静脉血微量法测血糖,血糖持续高于16.7 mmol·L^-1,尿糖+++或以上为模型制作成功。从成功造模的31只BN大鼠中，随机选取20只做后续实验。
1.2　微脉冲激光处理　造模成功2周后随机选取BN大鼠20只，行右眼阈值下577 nm微脉冲激光光凝术（微脉冲激光组）:先以每100 g体质量0.3 mL剂量腹腔注射50 g ·L^-1水合氯醛麻醉，复方托吡卡胺滴右眼散瞳，以玻片轻压眼球以看清眼底。采用IQ577 nm（美国IRIDEX公司）激光。先将激光调成连续波模式在周边部视网膜行阈能量测定，设定光斑直径：200 μm，曝光时间200 ms，设定视网膜刚变白时的能量为阈值能量。然后转换成微脉冲模式，微脉冲光凝参数：光斑直径200 μm，曝光时间200 ms，负载系数5%，400%的阈能量,在视盘周围以4点距阵方法行200个光凝点。左眼不做任何处理，作为对照组。
1.3　实时荧光定量PCR检测VEGF、NGF和Chemerin的mRNA相对表达量　上述20只BN大鼠于微脉冲激光损伤后3 d、7 d、14 d、28 d，各随机选取5只，予以足量50 g ·L^-1水合氯醛腹腔注射过量麻醉致死后取双侧眼球，除去眼肌、角膜、晶状体及玻璃体后制成眼杯,然后取视网膜加RIPA裂解液,利用Trizol法（Aidlab公司）提取视网膜RNA，用微量分光光度计测定RNA 2 μL样本的浓度和纯度，逆转录为cDNA。VEGF引物：上游5’-CGTCTACCAGCGCAGCTATTG-3’，下游5’-CTCCAGGGCTTCATCATTGC-3’，扩增引物长度145 bp；NGF引物：上游5’-GTGTGTGGGTTGGAGATAAG-3’，下游5’-GACAAAGGTGTGAGTCGTGG-3’，扩增引物长度206 bp；Chemerin引物：上游5’-CGGACTACATCGTGGACTTG-3’，下游5’-GTGGTAGTCCATAGCGGCAT-3’，扩增引物长度248 bp；GAPDH引物：上游5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’，下游5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3，扩增引物长度253 bp。反应体系：4 μL cDNA稀释10倍，SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL、灭菌蒸馏水5 μL。反应条件：预变性50 ℃ 2 min；变性95 ℃ 10 min；退火95 ℃ 30 s；延伸60 ℃ 30 s；共40个循环。每个样本设3个复孔。行熔解曲线测定特异性，最终数据以2^-ΔΔCt进行分析，GAPDH为内参进行校正，计算VEGF、NFG和Chemerin mRNA相对表达量。
1.4　Western blot检测VEGF、NGF和Chemerin蛋白表达　在行PCR检测的相同时间点进行Western blot检测VEGF、NGF和Chemerin蛋白表达。用含蛋白酶抑制剂的PBS 溶液制备视网膜组织匀浆，BCA法测定蛋白浓度。应用湿式电转移法经SDS凝胶电泳转到聚偏二氟乙烯膜。室温封闭，分别加入兔抗鼠VEGF一抗(1∶2000，英国Abcam公司)、兔抗鼠NGF一抗（1∶300，武汉博士德生物工程有限公司）、兔抗Chemerin一抗（1∶300，武汉三鹰生物技术有限公司），4 ℃孵育过夜，洗膜缓冲液(TBST)清洗3次，羊抗兔二抗(1∶50 000，武汉博士德生物工程有限公司) 37 ℃摇床孵育2 h。TBST清洗6次，暗室内显色曝光扫描。BandScan分析胶片灰度值。以GAPDH为内参进行校正，实验重复3次。
1.5　统计学处理　采用SPSS 19.0软件进行分析。整体比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，组间采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　VEGF、NGF和Chemerin mRNA表达结果　对照组3 d、7 d、14 d、28 d VEGF mRNA的相对表达量逐渐上升，差异有统计学意义（F=7.67,P<0.05）；微脉冲激光组VEGF mRNA的相对表达量在3 d、7 d、14 d、28 d均较对照组下降，差异均有统计学意义（t=-4.03、-3.17、-6.16、-1.82，均为P<0.05；见图1）。对照组3 d、7 d、14 d、28 d NGF mRNA的相对表达量相比差异有统计学意义（F=5.19，P<0.05），7 d时NGF mRNA比3 d时下降，但差异无统计学意义（P>0.05）；微脉冲激光组NGF mRNA的相对表达量在3 d、7 d、14 d、28 d均较对照组升高，且在14 d达到高峰，差异均有统计学意义（t=2.62、4.19、19.95、7.74，均为P<0.05；见图2）。对照组3 d、7 d、14 d、28 d Chemerin mRNA的相对表达量逐渐上升，差异有统计学意义（F=32.29,P<0.05）；微脉冲激光组3 d、7 d、14 d、28 d Chemerin mRNA的相对表达量均较对照组下降，差异均有统计学意义（t=-4.13、-3.49、-3.00、-3.78,均为P<0.05；见图3）。



2.2　VEGF、NGF和Chemerin蛋白表达结果　对照组3 d、7 d、14 d、28 d VEGF蛋白表达逐渐上升，差异具有统计学意义（F=113.97，P<0.05）；微脉冲激光组3 d、7 d、14 d、28 d VEGF蛋白表达均较对照组下降，差异均有统计学意义（t=-11.67、-12.85、-6.96、-7.26,均为P<0.05；见图4）。对照组3 d、7 d、14 d、28 d NGF蛋白表达逐渐下降（F=6.79,P<0.05）,7 d NGF蛋白比3 d下降，但差异无统计学意义（P>0.05）；微脉冲激光组3 d、7 d、14 d、28 d NGF蛋白表达均较对照组上升，差异均有统计学意义(t=4.95、6.32、8.04、7.21，均为P<0.05；见图5)，且在14 d达到高峰。对照组3 d、7 d、14 d、28 d Chemerin蛋白表达逐渐上升，差异有统计学意义（F=55.66，P<0.05）；微脉冲激光组3 d、7 d、14 d、28 d Chemerin蛋白表达均较对照组下降，差异均有统计学意义（t=-4.65、-4.57、-6.72、-8.62,均为P<0.05；见图6）。



3　讨论
    糖尿病视网膜病变是糖尿病主要并发症之一,其发病机制甚为复杂,有多种异常生化途径参与其中。高血糖的发生与多元醇途径、己糖胺途径亢进,蛋白激酶C激活，晚期糖基化终末产物生成有关。这四种生化途径促进氧化应激和炎症反应，可加重糖尿病视网膜病变病程。长期慢性低炎症反应促进RPE细胞、视网膜神经胶质细胞、视网膜微血管内皮细胞、视网膜微血管周细胞及成纤维细胞炎症介质的释放^［5-6］。眼内炎症介质的调节决定着炎症的进展、严重程度及愈合情况^［7］。传统激光光凝可使血管紧张素II受体等上调及FGF-14、FGF-16、IL-1等蛋白下调，从而达到治疗视网膜血管性疾病的目的。有学者认为，传统激光损伤耗氧量高的光感受器细胞，胶质细胞增殖迁移代替光感受器细胞，使得氧更能从脉络膜弥散到内层视网膜，改善内层视网膜氧供，从而减少VEGF等炎性因子的产生^［8-9］。但不断扩大的融合激光光斑、视网膜下纤维化及视网膜下新生血管形成均为其严重并发症。而阈值下577 nm微脉冲激光能够更好地被血红蛋白和RPE细胞吸收，减少了对神经感觉层和脉络膜的损伤^［1］,可有效避免上述并发症的发生,但其治疗的作用机制目前尚不十分清楚。本文主要探究阈值下577 nm微脉冲激光对在糖尿病视网膜病变进展过程中起重要作用的VEGF、NGF和Chemerin的影响，进一步明确阈值下577 nm微脉冲激光治疗的作用机制。
    已知低氧诱导因子1α是调节缺氧反应的转录因子之一，糖尿病视网膜病变缺氧状态下低氧诱导因子1α上调从而上调VEGF表达^［10］,上调的VEGF通过内皮细胞表面的VEGFR-2引起酪氨酸激酶反应，增加血管通透性并促进新生血管形成^［11］。本研究表明，阈值下577 nm微脉冲激光光凝后3 d、7 d、14 d、28 d均可降低VEGF mRNA和蛋白表达，说明阈值下577 nm微脉冲激光光凝短时期内在一定程度上可延缓或抑制糖尿病视网膜病变的进展。LIMA等^［12］研究发现，在激光损伤大鼠视网膜引起视网膜新生血管形成模型中，基质细胞衍生因子-1、VEGF等蛋白12 h内增加，随后下降，这可能与激光引起早期炎症反应及眼内新生血管形成等并发症相关。但本研究中，阈值下577 nm微脉冲激光损伤小，引起的炎症反应相对较小且不会引起纤维增生和新生血管形成。LIU等^［13］研究揭示了阈值下微脉冲激光光凝小鼠RPE细胞后，促血管生成因子VEGF-A、TGF-β和成纤维细胞生长因子均减少，这与本研究结果类似。我们认为，阈值下577 nm微脉冲激光光凝下调VEGF表达通过以下两个方面进行：（1）阈值下577 nm微脉冲激光光凝对RPE细胞产生生物调制效应从而下调VEGF的表达^［14-15］；（2）阈值下激光引起损伤部位周围的RPE细胞再生并迁移至损伤部位^［16］。低能量激光可引起再生的组织在修复过程中表达TGF-1β^［17］。由于TGF-1β可通过VEGF/flk-1信号通路下调VEGF^［18］，因此我们认为，阈值下577 nm微脉冲激光光凝可通过上调再生的RPE细胞表达TGF-1β从而下调VEGF的表达。但其具体信号通路还需进一步研究。
    NGF对神经细胞的增殖分化具有重要调节作用，且其能够促进人脐静脉血管内皮细胞及人皮肤微血管内皮细胞体外增殖和迁移,可作为评估糖尿病病程的一个指标^［19-20］。NGF在增生型糖尿病视网膜病变玻璃体内含量显著降低^［21］。阈值下810 nm微脉冲激光光凝人施万细胞后第20天，可使NGF mRNA表达增加^［22］。本研究也显示，阈值下577 nm微脉冲激光光凝治疗早期糖尿病BN大鼠后，NGF mRNA和蛋白含量短时间内增加,在14 d达到峰值，一定程度上延缓了糖尿病视神经病变的进展。
    Chemerin为趋化蛋白，可引起炎症反应并介导血管形成。通过Akt磷酸化作用和激活Akt信号通路促进血管生成,在糖尿病视网膜血管病变中发挥重要作用^［23］。增生型糖尿病视网膜病变患者玻璃体内Chemerin含量与糖尿病病程相关，且与VEGF因子含量具有相关性^［24］。本研究结果显示，随着病程进展Chemerin含量逐渐升高，其在糖尿病视网膜病变过程中起着重要作用。而阈值下577 nm微脉冲激光光凝后3 d、7 d、14 d、28 d，Chemerin mRNA和蛋白含量均减少,说明阈值下577 nm微脉冲激光光凝可短时间内减轻糖尿病视网膜病变炎症反应，延缓病程。
    微脉冲激光光凝治疗糖尿病视网膜病变的机制，一方面可能为微脉冲激光损伤RPE细胞，引起周边RPE细胞迁移、增殖，增强RPE屏障功能，从而减少视网膜下液、改善黄斑状态^［25］；另一方面可能为微脉冲激光光凝后亚致死区域RPE细胞内光受体改变病理环境下（如糖尿病）的细胞行为，使细胞功能包括因子表达正常并且炎症减少^［26］。阈值下577 nm微脉冲激光可降低VEGF、Chemerin，上调NGF，说明阈值下577 nm微脉冲激光光凝刺激视网膜ＲPE 细胞分泌细胞因子，可能起到预防或治疗视网膜新生血管，改善视神经状态的作用，但其具体的作用机制仍未清楚。作为一种不可见光凝斑的光凝方法，其量化标准如何?通过调节RPE细胞因子水平达到的治疗效果与抗VEGF抗体的临床疗效相比，是否有差异?这些问题都还需要我们进一步进行大量的实验研究来探讨。