《眼科新进展》  2017年8期 719-722   出版日期：2017-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
转基因荧光小鼠视神经轴索钝性损伤后退行性病变观察


    眼是脑的延伸，光被视网膜中的视杆、视锥细胞所接收，然后激发神经元信号并通过视神经中的投射神经元（视网膜神经节细胞）抵达丘脑中的外侧膝状体和中脑中的上丘，再将信息处理后传递至高级视觉中枢［1］。视神经由视网膜神经节细胞的轴突汇聚成的神经束和髓鞘构成，眼外伤或者其他疾病引起的视神经退行性病变是视力下降甚至致盲的主要因素之一。小胶质细胞作为中枢神经系统中重要的免疫细胞之一，其增殖、迁移、激活、相关分泌物质与视神经受损后的退行性病变、神经毒性环境和继发性损伤都有密切关联，但小胶质细胞等免疫细胞在视神经甚至中枢神经系统中的作用尚不明确。近年来，许多关于中枢神经系统受损后神经元退行性病变和相关免疫应答的研究都是通过视网膜-视神经模型来实现的［2-3］。过去对视神经相关的研究通常采用眼体积较大的大鼠或兔类，本文利用GFP-C57BL/6和THY1-YFP H-line转基因小鼠和视神经轴索钝性损伤手术，对视神经中神经元轴突的退行性病变和小胶质细胞变化之间的关系进行研究和探讨。
1　材料与方法
1.1　实验动物　YFP小鼠：THY1-YFP H-line转基因小鼠，其特点是脑皮层中第5层锥体神经元细胞可特异性表达黄色荧光蛋白，在激发光波长为（530±20）nm时呈现黄色，在激发光波长为（465±15）nm时呈现绿色。视神经中的神经轴突被绿色荧光标记，本实验利用这种绿色荧光标记，在视神经损伤后可观察到神经轴突的变化情况。
    GFP小鼠：GFP-C57BL/6转基因小鼠，其特点是中枢神经系统中小胶质细胞被绿色荧光标记。
    所有小鼠均购自兰州大学医学实验动物中心，4~6周龄，雌雄各半，体质量18~22 g，生活于正常的昼夜交替、无强光或噪声等刺激的环境中，自由活动及进食、饮水。
1.2　实验分组　YFP小鼠30只，其中5只为正常对照组，其余25只为视神经轴索钝性损伤手术组，根据术后时间分为术后4 h、1 d、3 d、5 d、10 d 5个时间组，每个时间组5只。GFP小鼠30只，分组同上。
1.3　主要试剂及主要仪器　50 g·L-1水合氯醛（美国Sigma公司），氨基甲酸乙酯（美国Sigma公司），0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液（美国Secoma公司），40 g·L-1多聚甲醛（美国Secoma公司）。荧光显微镜（日本OLYMPUS，型号DP72），共聚焦荧光显微镜（日本OLYMPUS，型号FV1000）。
1.4　视神经轴索钝性损伤模型　所有小鼠均左眼造模，右眼不作处理。小鼠用50 g·L-1水合氯醛按体质量0.01 mL·g-1腹腔注射麻醉，待麻醉完全后，将小鼠右侧卧位置于手术显微镜下。使用显微剪将结膜剪开一个约5 mm长的裂口，去除遮挡视线的泪腺。使用显微镊向鼻侧牵拉眼球，另持一镊钝性分离肌肉及其他组织，暴露视神经。用无创血管镊在眼球后端约2 mm处夹持视神经约10 s，放开镊子后观察到视神经断开且神经外层的鞘膜基本完整，说明手术初步成功。然后观察角膜及眼内血流状态，将严重眼内缺血或充血的小鼠淘汰，恢复眼球位置并缝合伤口，术中尽量避免出血。小鼠苏醒后8~12 h可以观察到瞳孔涣散无法聚光，行为避光，各时间组手术后初次选择5~10只无明显外伤的小鼠为成功模型，最终选择以无严重感染、无组织坏死溃烂的5只小鼠进行实验取材。
1.5　取材和成像处理　造模后4 h、1 d、3 d、5 d、10 d取材，将小鼠用氨基甲酸乙酯麻醉并用40 g·L-1多聚甲醛做心脏灌流后摘取双侧眼球并分离视神经，将视神经进行组织固定和透明处理后置于载玻片上，荧光显微镜观察成像，随机选取视野利用激光共聚焦显微镜对所选视野成像，对数据使用FV10-ASW 4.0、ImageJ 1.48软件进行处理。
2　结果
2.1　YFP小鼠观察结果　YFP小鼠视神经受损后的神经退行性病变随时间推移不断恶化且无再生趋势。与正常对照组相比，术后4 h损伤处视神经轴突断裂，还未开始退行性病变。术后1 d大部分视神经轴突在靠近损伤处的一端出现念珠样结构，视神经进入退行性病变进程。术后3 d大部分视神经轴突念珠化，视神经退行性病变加剧。术后5 d视神经轴突开始从念珠状转变为碎片状，视神经退行性病变快速恶化。术后10 d视神经轴突几乎已经损失殆尽，形成大量碎片，视神经外鞘膜也开始坏死，视神经退行性病变仍在持续恶化（图1）。
2.2　GFP小鼠观察结果　GFP小鼠视神经受损后小胶质细胞伴随着神经元轴突的退行性病变大量激活和增多。与正常对照组相比，术后4 h视神经损伤处开始愈合并形成胶质瘢痕，静息态小胶质细胞开始大量出现。术后1 d激活态小胶质细胞大量增多并开始覆盖受损区域。术后3 d大量的激活态小胶质细胞基本覆盖了受损区域。术后5 d、10 d虽然视神经的退行性病变持续恶化，但是小胶质细胞的数量基本保持稳定（图2）。
2.3左右眼对比　GFP小鼠手术眼（左眼）的视神经受损后呈现出典型的神经退行性病变的特征，但同时在未作手术的右眼中也观察到出现了大量的小胶质细胞（图3中5 d GFP 右眼），这可能与某种特殊的免疫应答机制和连接左右眼的视神经交叉有关。但是右眼视神经的轴突从YFP小鼠的结果可知并没有进入退行性病变进程（图3中 5 d YFP 右眼），这种现象说明炎症因子、免疫调节因子和神经胶质环境的改变可以通过视神经交叉扩散开来，小胶质细胞虽然被激活、迁移和聚集但并没有产生炎症反应，进一步说明视神经的免疫活性较低，这类免疫豁免机制可能与这类中枢神经中存在特异性抑制物或者缺乏化学诱导物有关。





3　讨论
    眼内的视网膜和视神经中存在的创伤应激、病理机制、炎症反应和免疫应答等与脑和脊神经中的十分相似，所以眼是中枢神经系统研究的重要模型［4-5］。视神经钝性损伤后轴突的退行性病变过程可以分为三个阶段：一是起始阶段：损伤后4 h，眼球后端的视神经轴突损伤处呈断开状态，伤口开始愈合，形成胶质瘢痕，静息态小胶质细胞大量出现，其中部分激活增多并向受损区迁移。二是退行性病变阶段：损伤后1~5 d，视神经轴突从部分念珠化到大量念珠化，说明神经轴突已经进入退行性病变进程，可以观察到激活态小胶质细胞大量增多并覆盖部分损伤区。三是视神经退行性病变快速恶化阶段：损伤后5 d，视神经轴突的退行性病变持续恶化，轴突从念珠状转变为碎片状，激活态小胶质细胞大量聚集，且数量基本保持稳定，在这一阶段中虽然小胶质细胞的激活和聚集现象十分明显，但实际上并没有起到清除髓鞘和轴突碎片的作用。损伤后10 d，视神经轴突的退行性病变仍在持续恶化，小胶质细胞在视神经中的聚集状态与5 d时没有本质上的区别，少数小胶质细胞有向静息态转变的趋势，神经外的鞘膜也开始瓦解。实验中发现小鼠单侧眼损伤后，其对侧眼中也出现了大量的小胶质细胞，这些细胞虽然被激活但并没有对正常的神经轴突产生影响，说明视神经内免疫活性较低，小胶质细胞并不是持续恶化的主要因素。
    小鼠视神经中的退行性病变与大多数中枢神经系统相似，视神经损伤后，总体上随着小胶质细胞的激活增多，轴突的退行性病变持续快速恶化。在中枢神经系统退行性疾病中，激活的小胶质细胞会产生细胞因子、神经营养因子、炎症因子和神经毒性分子等［6-9］。在视网膜发育中，小胶质细胞可以引起视网膜神经节细胞的凋亡［10-12］。在成体中，通过巨噬细胞集落刺激因子促进小胶质细胞激活后，会加剧视神经的退行性病变。抑制小胶质细胞激活或通过外周神经移植物改变神经微环境，可以阻碍视神经受损引起的退行性病变，所以目前小胶质细胞总体上被认为有可能加剧神经元的损伤［12-17］。但近期研究认为，小胶质细胞可以分为M1型和M2型等［18］，这类细胞具有吞噬作用的同时也是一种抗原呈递细胞［19］，在中枢神经系统中可能参与血管的形成和调控［20-21］，所以这类细胞在中枢神经免疫应答中起到的作用应该远比目前揭示的现象复杂。综上所述，视神经受损后的神经退行性病变随时间推移不断恶化且无再生趋势，小胶质细胞随退行性病变大量激活增多，但在中枢神经系统损伤中复杂的机制仍有待进一步研究。