《眼科新进展》  2017年8期 705-708   出版日期：2017-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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不同浓度肽聚糖对角膜上皮细胞Toll样受体(TLR)2和TLR4表达的影响


    感染性角膜炎是临床常见的疾病，致病病原体包括细菌、真菌、病毒等，其中以革兰阳性葡萄球菌最为常见^［1］。研究表明，肽聚糖是革兰阳性葡萄球菌胞壁主要组成成分之一,也是天然免疫反应最强的刺激剂^［2-3］。Toll样受体家族(toll like receptors，TLRs)在天然免疫反应中扮演重要角色，其中TLR2、TLR4在角膜上皮细胞广泛表达，成为研究感染性角膜炎免疫反应的着眼点^［4-5］。本实验以角膜上皮细胞为研究对象，观察不同浓度肽聚糖作用不同时间对角膜上皮细胞TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达的影响，初步探讨其机制，为感染性角膜炎的临床治疗提供新的思路。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验试剂与仪器　DMEM/F12培养基和胎牛血清（美国Gibco公司），金黄色葡萄球菌肽聚糖和胰蛋白酶(日本Sigma公司)，FITC标记抗小鼠TLR2单抗和PE/CY7标记抗小鼠TLR4单抗（美国Ebioscience公司），Cytokeratin 19抗体（英国Abcam公司），RNA提取试剂盒(美国OMEGA公司)，逆转录试剂盒和qPCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，TLR2、TLR4引物（南京金思特科技公司），实时荧光定量PCR仪(美国ABI7500)，流式细胞仪(美国BD公司)，倒置显微镜（日本Nikon公司）。
1.1.2　实验分组　将原代培养的C57小鼠角膜上皮细胞随机分为对照组（无肽聚糖刺激）及按照肽聚糖刺激浓度分为10 mg·L^-1组、30 mg·L^-1组、80 mg·L^-1组（作用时间均为12 h）；按照肽聚糖刺激时间分为12 h组、24 h组、36 h组（作用浓度均为30 mg·L^-1）。
1.2　方法
1.2.1　小鼠角膜上皮细胞体外培养及免疫荧光染色　（1）取材:以颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下摘除眼球，并置于D-Hank液(含 300 mg·L^-1青链霉素)中漂洗2遍，显微镜下分离角膜组织并用含抗生素的无菌磷酸盐缓冲液反复冲洗待用。（2）消化法原代培养角膜上皮细胞：将角膜组织置于6孔培养皿内，加入25 g·L^-1胰蛋白酶/EDTA（1∶1）消化30 min，用吸管反复吹打角膜上皮细胞面，使上皮细胞脱落形成单细胞悬液，离心弃上清，往沉淀中加入适量完全培养基后重悬细胞，最后接种至12孔培养皿常规培养，每2~3 d换液1次，每天在光学显微镜下观察细胞生长状况并拍照记录。待细胞融合至80％时可传代或进行下一步实验。（3）角膜上皮细胞爬片培养：将原代细胞接种在处理好的爬片上，加入40 g·L^-1多聚甲醛固定，进行免疫荧光化学染色，倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。所有实验均重复3次。
1.2.2　实时荧光定量PCR检测角膜上皮细胞TLR2、TLR4 mRNA相对表达量　TLR2、TLR4引物序列分别为125 bp、106 bp。将各组细胞充分机械匀浆后，按照RNA 提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，以DEPC水为空白对照，测得RNA 浓度和吸光度比值A₂₆₀/A₂₈₀为1.9~2.2。用TaKaRa 逆转录试剂盒进行逆转录反应合成cDNA。以GAPDH为内参，各引物基因序列:GAPDH 上游引物:5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物:5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’；TLR4上游引物：5’-ATGGCATGGCTTACACCACC-3’，下游引物:5’-GAGGCCAATTTTGTCTCCACA-3’；TLR2上游引物:5’-TGTGAACCTCCAGGCTCTG -3’，下游引物:5’-GTCCATATTTCCCACTCTCAGG -3’，参照TaKaRa公司的说明配置反应液进行PCR反应，扩增条件:95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。制定各基因的标准曲线，并测定各样本反应液的熔解曲线。每样本做3个复管。采用2^-ΔΔCt方法计算各基因的相对表达量。
1.2.3　流式细胞仪检测角膜上皮细胞TLR2、TLR4蛋白表达量　收集各组细胞，经结合缓冲液洗涤2次,离心后去上清，将细胞重悬于100 μL结合缓冲液内，加入标记抗体FITC-抗鼠TLR2、PE/CY7-抗鼠TLR4各1 μL，4 ℃避光染色30 min。随后，加入100 μL结合缓冲液重悬细胞，在488 nm处，用流式细胞仪检测荧光信号。所有实验重复3次，结果用FlowJo 7.6软件获取和分析数据。
1.3　统计学方法　应用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，所有实验均重复3次。本研究中检测指标的数据资料经W检验呈正态分布，用均数±标准差（x?±s）表示，组间均数经Levene检验方差齐，方差不齐的组间比较采用矫正t检验。各组细胞的检测指标总体差异比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　细胞形态及鉴定结果　普通光学显微镜观察发现角膜上皮细胞呈卵圆形或多角形，细胞相互紧密连接呈膜状生长（图1）。倒置荧光显微镜下观察发现细胞特异性地表达了角化蛋白CK19（红色荧光），证明本实验原代培养的细胞为角膜上皮细胞（图2）。




2.2　角膜上皮细胞TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达　与对照组相比，10 mg·L^-1组、30 mg·L^-1组、80 mg·L^-1组角膜上皮细胞TLR2、TLR4 mRNA表达量增加，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。与对照组相比，12 h组角膜上皮细胞TLR2、TLR4 mRNA表达量增加，差异亦均有统计学意义（均为P＜0.05）。蛋白表达与mRNA相一致：与对照组相比，10 mg·L^-1组、30 mg·L^-1组、80 mg·L^-1组角膜上皮细胞TLR2、TLR4蛋白表达增加，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。与对照组相比，12 h组角膜上皮细胞TLR2、TLR4蛋白表达量增加，差异均有统计学意义（均为P＜0.05，见表1-表2）。




3　讨论
    金黄色葡萄球菌是感染性角膜炎的常见病原菌，其致盲率极高。既往研究表明^［6］，金黄色葡萄球菌的毒性致病因子除了外毒素如：α-毒素和β-毒素外，还包括细菌胞壁组成成分如肽聚糖、磷脂酸等。袁钊辉等^［7］通过分别向大鼠玻璃体腔内注射肽聚糖和灭活细胞碎片发现，肽聚糖除了诱导SD大鼠产生典型的实验性眼内炎外，还刺激巨噬细胞、中性粒细胞等非特异性免疫细胞分泌炎症因子，进一步加重组织损伤，提示肽聚糖不仅自身具有强烈的免疫原性,还可以通过活化非特异性免疫细胞,启动先天性免疫反应。先天性免疫反应主要通过模式识别受体如TLR识别病原相关分子模式，继而启动非特异性抗感染反应^［8-9］。目前，TLR2、TLR4是TLRs中研究最清楚的成员之一，广泛表达在多种非特异性免疫细胞表面^［10-11］。刘苏俊等^［12］利用金黄色葡萄球菌肽聚糖刺激人角质形成细胞（HaCaT细胞），发现肽聚糖可以促使该细胞高表达TLR2及其下游信号分子如髓样分化因子Myd88、细胞外调节蛋白激酶、核转录因子NF-κB等。CAO等^［13］研究发现坏死性肠炎患者的肠上皮细胞内TLR4、NF-κB、干扰素-γ mRNA表达量较正常人显著增加，考虑与致病脆弱杆菌胞壁成分肽聚糖有关，推测肽聚糖可能作为一类病原相关分子模式，通过激活TLR4及其下游信号通路继而增强炎症反应。
    近年来，对角膜上皮细胞的研究也取得一定进展，但在感染性角膜炎中，细菌胞壁成分肽聚糖如何与角膜上皮细胞表面TLR2和TLR4相互作用却未见报道。因此，本实验通过观察金黄色葡萄球菌肽聚糖对小鼠角膜上皮细胞TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达的影响，发现无肽聚糖刺激的角膜上皮细胞可以稳定地低表达TLR2和TLR4。当加入不同浓度肽聚糖刺激培养后，各组角膜上皮细胞TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达量均较对照组显著升高，推测当角膜受到细菌等病原体侵袭时，角膜上皮细胞表面的TLR2、TLR4可能通过其胞内TIR结构域识别并结合肽聚糖，继而激活髓样分化因子Myd88依赖性信号通路,刺激NF-κB、干扰素-γ等炎症因子分泌,最终诱发炎症反应^［14-15］。
    本实验另一发现是，角膜上皮细胞TLR2、TLR4的表达情况与肽聚糖刺激浓度、时间密切相关。随着肽聚糖浓度逐步增加，角膜上皮细胞TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达量呈现先升后降的趋势，即当刺激浓度为30 mg·L^-1时，TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达量已达峰值水平，继续加大刺激浓度，细胞TLR2、TLR4 mRNA和蛋白的表达量略有下降。此外发现，肽聚糖可以在短时间内与角膜上皮细胞发生作用,混合培养12 h时细胞即高表达TLR2、TLR4 mRNA和蛋白。这一现象说明，角膜上皮细胞TLR2、TLR4及其介导的信号通路可能存在一定的负反馈调节机制，这与LI等^［16］的研究结果相似，角膜上皮细胞可能与巨噬细胞、树突状细胞一样存在“TLR耐受”现象，即当外源性病原体毒力过强或刺激时间过长时，机体对这种“致死性”的损伤出现反应性下降和炎症因子分泌减少的现象，目的是通过启动与炎症相关的适应性调节，控制炎症反应的程度，避免过度激烈的炎症反应加重组织、器官损伤，这可能是角膜上皮虽长期暴露在外界微生物及其产物的环境下，却依然能保持免疫静息的原因之一。
    综上所述，小鼠角膜上皮细胞可以功能性表达TLR2、TLR4，并可能通过TLR2、TLR4识别外界致病微生物的特定成分，启动天然性免疫反应，为角膜防御外来刺激筑起第一道防线。同时，当角膜受到过强的外来刺激时，角膜上皮细胞可能通过诱导“TLR耐受”，避免角膜出现不可控性炎症反应，以保护角膜组织和视功能。然而“TLR耐受”出现的原因和具体作用机制尚不明确，这将成为下一步实验研究的方向和着眼点。