《眼科新进展》  2017年8期 701-704   出版日期:2017-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
N-乙酰-5-羟色胺(NAS)对视网膜缺血再灌注损伤(RIRI) 大鼠视网膜活性Caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响


    视网膜缺血再灌注损伤(retina ischemia-reperfusion injury,RIRI)是目前常见的视网膜疾病,如青光眼、缺血性视神经病变、视网膜和脉络膜血管阻塞、糖尿病视网膜病变等,严重威胁着人们的视力,也是目前致盲的主要原因。因此,RIRI的预防和治疗也成为眼科学研究的热点,寻找其行之有效的治疗方案并探讨其相关机制将为RIRI的治疗提供新思路。N-乙酰-5-羟色胺(N-acetylserotonin,NAS)是褪黑素的前体物质[1],可转化为褪黑素发挥其神经保护作用,同时还具有抑制凋亡的作用。研究发现NAS可减轻缺血脑损伤大鼠神经细胞的凋亡,具有神经保护作用[2],但NAS对大鼠RIRI是否具有保护作用及相关机制尚未见报道,弄清其对RIRI的影响并探讨其机制对预防和治疗RIRI具有重要意义。本研究采用升高眼压法建立RIRI模型,探讨NAS对视网膜形态结构及活性Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响,以期为RIRI的治疗提供科学的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物及分组 取健康成年Sprague-Dawley大鼠66只,体质量200~250 g,采用随机数字表法随机分为正常对照组(6只)、缺血再灌注组(30只)与药物组(30只),缺血再灌注组与药物组按RIRI后时间,分为6 h、12 h、24 h、48 h、72 h五个亚组。药物组于造模前30 min腹腔注射5 mg·kg-1 NAS,缺血再灌注组腹腔注射同等剂量的生理盐水。
1.1.2 主要试剂 NAS(美国Sigma-Aldrich公司),兔抗活性Caspase-3(美国Cell Signaling Technology公司),兔抗Bcl-2、兔抗Bax(美国Abcam 公司),兔抗二步法试剂盒、DAB显色剂试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),HE染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 RIRI模型的制作 采用升高眼压法建立大鼠RIRI模型[3],100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉,盐酸奥布卡因滴眼液局部麻醉,小儿头皮针自颞侧角膜缘刺入大鼠左眼前房并固定,升高眼压至110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)后,可见角膜逐渐雾浊,结膜苍白,前房变深,眼底镜见视网膜色淡,血管血流中断,60 min后逐渐降低输液瓶高度,从而缓慢降低眼压,直至眼压恢复正常,可见角膜逐渐清亮,视网膜恢复血供,RIRI模型成功建立。
1.2.2 取材及石蜡切片的制作 各组分别于RIRI后的6 h、12 h、24 h、48 h及72 h取眼球,40 g·L-1多聚甲醛固定,冲洗后常规梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。将包埋好的标本,平行于视神经矢状轴且以其为平面进行非连续切片,每4~5张切片取一张,切片厚约4 μm。
1.2.3 HE染色 石蜡切片脱蜡至水,苏木素液染色6 min,双蒸水冲洗两次,体积分数1% 盐酸酒精分化,自来水冲洗,梯度酒精脱水;伊红染色,体积分数95%酒精分色;无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察。
1.2.4 免疫组织化学染色 石蜡切片60 ℃烤片2 h,脱蜡至水,热修复抗原,体积分数3%H2O2消除内源性过氧化物酶,正常山羊血清封闭后,加入兔抗活性Caspase-3(1∶75)、兔抗Bcl-2(1∶200)、兔抗Bax(1∶200) 一抗,4 ℃冰箱中过夜;复温后0.01 mol·L-1 磷酸盐缓冲液冲洗,加兔抗大鼠多克隆抗体,DAB显色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。光学显微镜下观察,每只大鼠取4~5 张非连续切片,计数活性Caspase-3、Bcl-2、Bax阳性细胞数。
1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析,所有计量资料均以均数±标准差表示。方差齐性资料,采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HE染色结果 HE染色显示正常对照组大鼠视网膜结构清晰,各层细胞排列紧密;缺血再灌注组大鼠RIRI后6 h、12 h视网膜各层高度水肿,24 h后水肿逐渐减轻,神经节细胞逐渐减少,分布较紊乱,随着时间延长,视网膜神经节细胞大片缺失;药物组6 h、12 h较缺血再灌注组细胞水肿明显减轻,24 h、48 h、72 h组较缺血再灌注组细胞排列规整,神经节细胞数量减少减轻(图1)。



2.2 各组大鼠视网膜活性Caspase-3蛋白表达的变化 正常对照组大鼠视网膜活性Caspase-3阳性细胞较少,活性Caspase-3阳性细胞数为(102.89±18.97)个·mm-2;RIRI后6 h,缺血再灌注组视网膜活性Caspase-3阳性细胞数在灌注后6 h开始增加,24 h达到较高水平,随后逐渐下降;药物组各时间点视网膜活性Caspase-3阳性细胞数均显著少于缺血再灌注组,差异均有统计学意义(均为P<0.05,见图2、表1)。
2.3 各组大鼠视网膜Bcl-2蛋白表达的变化 正常对照组视网膜可见大量Bcl-2阳性细胞,Bcl-2阳性细胞数为(1634.45±345.26)个·mm-2;缺血再灌注组RIRI后6 h Bcl-2阳性细胞开始下降,12 h后继续减少,24 h降至较低水平;药物组各时间点Bcl-2阳性细胞数均显著多于缺血再灌注组,差异均有统计学意义(均为P<0.05,见图3、表2)。






2.4 各组大鼠视网膜Bax蛋白表达的变化 正常对照组大鼠视网膜Bax阳性细胞较少,Bax阳性细胞数为(108.59±29.93)个·mm-2;缺血再灌注组RIRI后6 h神经节细胞层及内核层可见Bax阳性细胞,24 h达到较高水平,48 h开始下降;药物组各时间点Bax阳性细胞均显著少于缺血再灌注组,差异均有统计学意义(均为P<0.05,见图4、表3)。




3 讨论
    NAS属于吲哚类激素,是褪黑素的前体物质[4]。OXENKRUG等[5]给大鼠皮下注射NAS,发现大鼠脑和肾中脂质过氧化率减少,首次展示了NAS的抗衰老作用。YU等[6]研究了NAS对小鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用,发现NAS能减少血清中天冬氨酸氨基转移酶含量,减少肝脏组织学损伤,降低Caspase-3的水平,表明NAS可以抑制缺血再灌注后的肝细胞凋亡。SHAHAR等[7]通过建立大鼠肠缺血再灌注损伤模型,观察了NAS对缺血再灌注后肠道细胞的保护作用,发现NAS可以预防肠黏膜损伤,抑制大鼠肠缺血再灌注损伤后的细胞凋亡。本实验将NAS用于大鼠RIRI模型中,以期研究NAS对大鼠RIRI后视网膜神经细胞的保护作用。
    在RIRI中,细胞凋亡是损伤的主要形式之一。Caspase-3是细胞凋亡途径的终末蛋白,又称死亡蛋白,通常是以无活性的Caspase-3前体存在的。当细胞受到外界有害物质刺激或者接受凋亡信号后,Caspase-3活化变成活性Caspase-3,活性Caspase-3作为Caspase-3的活化形式,在凋亡的发生过程中具有重要意义,其表达程度可反映Caspase-3的活性和细胞凋亡情况,因此活性Caspase-3是判断细胞凋亡严重性的可靠指标之一。本研究中,正常对照组有极少量的活性Caspase-3阳性细胞表达,RIRI后6 h,活性Caspase-3阳性细胞明显增多,于24 h达较高水平,随后逐渐下降,说明RIRI的发生与凋亡密切相关,这与文献报道一致[8],经NAS干预后,药物组各时间点活性Caspase-3阳性细胞均显著少于缺血再灌注组,提示NAS可抑制RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡。
    研究表明,Bcl-2家族成员在凋亡过程中起着关键作用[9]。Bcl-2是最重要的抗凋亡蛋白,可以阻断细胞色素C释放至细胞质,抑制下游凋亡级联反应[10]。Bax是促凋亡蛋白,它通过与Bcl-2的同源结构域结合形成异源二聚体,封闭Bcl-2活性,促进细胞色素C穿过线粒体膜,导致细胞凋亡[11]。本研究中,药物组RIRI后6 h Bcl-2阳性细胞开始下降,12 h后继续减少,24 h降至较低水平,显著多于缺血再灌注组,提示经NAS干预后Bcl-2蛋白表达上调;而缺血再灌注组RIRI后6 h神经节细胞层及内核层可见Bax阳性细胞,于24 h达到较高水平,72 h下降,药物组各时间点Bax阳性细胞均显著少于缺血再灌注组,说明在NAS的作用下Bax蛋白表达降低,提示NAS抑制RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的机制可能与促进Bcl-2蛋白的表达,同时,抑制Bax蛋白表达有关。
    总之,NAS可促进RIRI大鼠视网膜Bcl-2蛋白的表达,抑制Bax蛋白的表达,从而抑制活性Caspase-3蛋白表达,减轻细胞凋亡,具有神经保护作用,这为RIRI的临床治疗提供新思路。