《眼科新进展》  2017年6期 531-534   出版日期：2017-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
LncRNA MT1JP对葡萄膜黑色素瘤细胞迁移和侵袭的影响


    葡萄膜黑色素瘤是成人常见的眼内恶性肿瘤，起源于葡萄膜黑色素细胞，发病率为0.02%~0.06%，其具有易于增殖和转移的特点［1］。据报道，葡萄膜黑色素瘤5 a致死率为17%~50%，常发生肝脏转移。一旦发生肝脏转移，预后极差，生存期仅2~7个月，仅13%的患者存活超过1 a［2］。但葡萄膜黑色素瘤的发病机制目前尚不清楚。长链非编码RNA（long noncoding RNAs，LncRNAs）是一种长度为200 nt的非编码RNA［3］。LncRNAs已被发现广泛参与肿瘤生物学过程，包括细胞周期调控、细胞凋亡、细胞分化等［4-6］。LncRNA MT1JP是一种新发现的LncRNA，在肝癌、胃癌、结肠癌和肺癌中低表达，且起着抑癌基因的作用［7］。然而，LncRNA MT1JP在葡萄膜黑色素瘤中的表达情况如何，其对葡萄膜黑色素瘤迁移和侵袭的影响如何，尚未见相关报道。本研究着重在体外探讨LncRNA MT1JP对葡萄膜黑色素瘤细胞迁移和侵袭的影响及可能的机制。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂　SP6.5、M23细胞系及视网膜色素上皮细胞系ARPE-19购自北京大学实验医学中心，P53和GAPDH一抗均购自美国BD公司，二抗购自美国Invitrogen公司。pcDNA3.1-MT1JP、pcDNA3.1-siMT1JP及 pcDNA3.1载体均于广州锐博生物科技有限公司定制。LipofectamineTM2000转染试剂购自美国BD公司。
1.2　细胞培养　葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5、M23及正常视网膜色素上皮细胞系ARPE-19用DMEM培养基培养于37 ℃、体积分数5%二氧化碳、饱和湿度的恒温细胞培养箱中。
1.3　细胞转染及分组　细胞以每孔100×103个接种于12孔板，孵育12 h后进行转染，将SP6.5分成3组，即MT1JP组、siMT1JP组和NC组，用LipofectamineTM2000分别转染pcDNA3.1-MT1JP、pcDNA3.1-siMT1JP和pcDNA3.1空载体，最终转染浓度为20 nmol·L-1。
1.4　RNA提取和实时荧光定量PCR　采用Trizol reagent（Invitrogen，美国）提取M23、ARPE-19、SP6.5细胞的总RNA后，使用NanoDrop1000分光光度计（美国 Thermo Scientific 公司）测定各组RNA浓度，将所得的RNA使用ImPron-Ⅱ反转录系统（Roche，美国）逆转录，在7900HT实时荧光定量PCR系统（美国 Applied Biosystems）进行定量。所需的引物序列如下：LncRNA MT1JP正向引物：5’-GGGACTCCTTTACTTCCTTGG-3’，反向引物：5’-CCTTGAGCCTCAGTATCCTTAAC-3’；GAPDH 基因作为内参，正向引物：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，反向引物：3’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5’。采用 2-ΔΔCt公式计算 LncRNA MT1JP 的相对表达量。
1.5　细胞迁移能力测定　采用细胞划痕实验，将MT1JP组、siMT1JP组和NC组细胞接种于6孔板，培养24 h后，用200 μL Tips枪头沿培养孔划直线，计算划痕后即刻和48 h的划痕面积，并计算划痕愈合率，实验在标准状态下重复3次，取平均值。划痕愈合率=（划痕后即刻的划痕面积-划痕后48 h的划痕面积）/划痕后即刻的划痕面积×100%。迁移能力越强，划痕愈合率越高。
1.6　细胞侵袭能力测定　采用Transwell侵袭小室进行实验。MT1JP组、siMT1JP组和NC组各取20×103个细胞接种于Transwell小室的碳酸磷脂表面，经在室内37 ℃条件下培养24 h后，用10 g·L-1多聚甲醛与膜下面的细胞结合并用2 g·L-1结晶紫溶液染色，随机取10个视野（200倍），计算穿过膜的细胞数量，实验重复3次，取平均值。
1.7　P53蛋白表达检测　采用Western blot法检测P53蛋白的表达。MT1JP组、siMT1JP组和NC组细胞培养24 h后收集细胞，裂解蛋白后上样，上样量以每孔30 μg为标准，电泳条件：浓缩胶60 V 50 min，分离胶 80 V 2 h，转膜后，PBST漂洗3遍，按1∶200的浓度配比抗体后加入并孵育过夜，PBST漂洗3次，按1∶500浓度加入二抗，并在37 ℃下孵育2 h，ECL显影，计算P53蛋白相对灰度值。
1.8　统计学分析　采用Graphpad 5.0作图软件作图，计量资料用x?±s表示，两组均数采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　LncRNA MT1JP的表达　实时荧光定量PCR结果示：在葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5和M23中，LncRNA MT1JP的相对表达量分别为0.20±0.02和0.31±0.01，显著低于正常视网膜色素上皮细胞系ARPE-19的1.0（均为P<0.01）。
2.2　细胞迁移能力的比较　SP6.5细胞转染48 h后，siMT1JP组LncRNA MT1JP相对表达量为0.32±0.02，MT1JP组为132.00±13.00，NC为1.00，3组间两两相比差异均有统计学意义（均为P<0.05），提示转染成功。
    细胞划痕实验结果示：siMT1JP组划痕愈合率为61.5%±3.7%，MT1JP组为10.6%±1.7%，NC组为20.0%±2.1%，3组间两两相比差异均有统计学意义（均为P<0.01），siMT1JP组划痕愈合率显著高于NC组和MT1JP组，MT1JP组划痕愈合率显著低于NC组（图1）。



2.3　细胞侵袭能力的比较　Transwell实验结果示：在200倍视野下，siMT1JP组侵袭细胞数为（75.6±6.8）个，MT1JP组侵袭细胞数为（10.3±2.6）个，NC组为（29.5±3.9）个，3组间两两相比差异均有统计学意义（均为P<0.01），siMT1JP组侵袭细胞数显著多于NC组和MT1JP组，MT1JP组侵袭细胞数显著少于NC组（图2）。
2.4　LncRNA MT1JP调控P53蛋白表达　Western blot测定结果示：siMT1JP组P53蛋白相对表达量为0.41±0.04，显著低于NC组的1.0（P<0.01）；MT1JP组P53蛋白相对表达量为5.73±0.62，显著高于NC组的1.0（P<0.01，见图3）。




3　讨论
    葡萄膜黑色素瘤是成年人常见的眼内恶性肿瘤，起源于葡萄膜黑色素细胞，好发于白种人，发病率为黑种人的8.5倍［8］。按改良Callender分型系统，病理分型可分为梭形细胞型、类上皮细胞型及混合细胞型和其他类型［2］。其生长方式包括内生长、外生长及扁平弥散生长。肿瘤直径、病理分型、切缘都为影响葡萄膜黑色素瘤预后的重要因素［9］。手术仍是治疗葡萄膜黑色素瘤的最有效方法之一。但葡萄膜黑色素瘤5 a生存率仍不乐观，据报道［10］，肿瘤直径<15.0 mm的葡萄膜黑色素瘤5 a生存率达88.4%，而对于直径≥16.0 mm者，5 a生存率仅为43.0%。
    LncRNA是近期肿瘤学领域的研究热点，越来越多的研究表明，LncRNA与肿瘤有密切关系。比如，LncRNA MALAT1被发现在肝癌、结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌组织中均存在表达异常［11-15］，LncRNA NNT-AS1在结肠癌中较癌旁组织高表达，且与结肠癌TNM分期、淋巴结转移、血管侵犯及分化有关，沉默其表达可显著抑制结肠癌的增殖、迁移和侵袭，LncRNA NNT-AS1是影响结肠癌预后的一个独立影响因素［16］。帅勇锋等［17］报道LncRNA SNHG15在甲状腺癌细胞系中高表达，沉默其表达可抑制甲状腺癌细胞增殖，并促进其凋亡。LncRNA也参与葡萄膜黑色素瘤发生发展等过程，SUN等［18］报道LncRNA MALAT1 在葡萄膜黑色素瘤较正常葡萄膜组织高表达，在葡萄膜黑色素瘤细胞系中敲除LncRNA MALAT1可抑制增殖、克隆形成、侵袭和转移，起抑癌基因的作用。
    LncRNA MT1JP被发现在肝癌、胃癌、肠癌及肺癌中低表达［7］，本研究发现，较正常细胞系，LncRNA MT1JP在葡萄膜黑色素瘤细胞系中低表达，对SP6.5细胞转染LncRNA MT1JP使其高表达后，行细胞划痕和侵袭实验发现，LncRNA MT1JP高表达后划痕愈合率和侵袭细胞数均显著低于NC组，LncRNA MT1JP沉默后划痕愈合率和侵袭细胞数均显著高于NC组，表明LncRNA MT1JP可抑制葡萄膜黑色素瘤细胞迁移和侵袭，起肿瘤抑制作用，这与LIU等［7］的研究结果类似。
    转录因子P53是一个重要的肿瘤抑制因子，有报道示LncRNA可调控P53的表达，比如LincRNA-p21被报道为p53的阻遏物，可通过阻遏P53的表达而诱导凋亡的发生［19］。P53可诱导lncRNA PANDA，并在细胞周期和凋亡通路中起着关键性作用［20-21］。LncRNA MT1JP是P53信号通路的一个重要调节因子，其通过促进P53 mRNA的转录而促进P53蛋白表达，而P53蛋白广泛地调控着细胞周期、增殖、凋亡、迁移和侵袭等肿瘤生物学过程。本研究发现，MT1JP基因沉默后的SP6.5细胞的P53蛋白表达水平显著低于NC组，与此同时，MT1JP过表达后SP6.5细胞的P53蛋白表达水平显著高于NC组。说明MT1JP能提高P53在SP6.5细胞中的蛋白表达水平，这与LIU等［7］的结果相符。其可能的机制为MT1JP过表达促进P53的表达进而抑制葡萄膜黑色素瘤的转移和侵袭。
    综上，本研究在体外发现LncRNA MT1JP在葡萄膜黑色素瘤细胞系中低表达，上调LncRNA MT1JP的表达可抑制葡萄膜黑色素瘤的转移和侵袭，并诱导P53蛋白表达上调，这为了解葡萄膜黑色素瘤的发病机制提供了新的思路，可能作为葡萄膜黑色素瘤的新的治疗靶点。