《眼科新进展》  2017年6期 527-530   出版日期：2017-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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白皮杉醇对青光眼大鼠视网膜神经节细胞的保护作用


    青光眼是全球第二大致盲性眼病，主要表现为慢性进展性的视神经病变^［1］，早期以神经节细胞凋亡为基本特征^［2］，发病机制十分复杂，涉及氧化应激、细胞凋亡等^［3］。白皮杉醇是白藜芦醇的衍生物^［4］，国外学者研究发现人工合成的白皮杉醇具有抗氧化和清除自由基的功效^［5-6］，且白皮杉醇的抗氧化作用强于白藜芦醇。有关白皮杉醇对青光眼视网膜保护作用方面的报道尚少，本文建立青光眼大鼠模型，通过给予不同剂量白皮杉醇，观察白皮杉醇对视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）凋亡的抑制作用，并初步探讨其可能的作用机制。
1　材料与方法
1.1　实验动物　健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，40只，10~12周龄，体质量200~220 g，购自南京君科生物工程有限公司，饲养于（25±2） ℃，昼夜各12 h，适应性饲养1周。
1.2　主要试剂　白皮杉醇购自杭州广林生物医药有限公司；原癌基因蛋白Jun（proto oncogene protein Jun，c-Jun）、磷酸化c-Jun（phosphorylation c-jun，p-c-Jun）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK)、磷酸化JNK（phosphorylation JNK，p-JNK）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)抗体购于美国Santa Cruz公司；细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷酸化ERK（phosphorylation ERK，p-ERK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38 MAPK)与磷酸化p38 MAPK（phosphorylation p38 MAPK，p-p38 MAPK)抗体购自碧云天生物技术有限公司。
1.3　青光眼大鼠模型建立与分组　将40只大鼠随机均分为对照组、模型组、白皮杉醇低剂量组和白皮杉醇高剂量组，每组各10只。除对照组外，其余各组大鼠均进行青光眼模型的建立。腹腔注射100 g·L^-1水合氯醛麻醉大鼠，沿眼睑内缘滴入4 g·L^-1奥布卡因滴眼液进行局部麻醉，于颞上、颞下和鼻上象限沿角膜缘剪开相应的球结膜，分离显示巩膜上静脉，采用532 nm激光灼烧巩膜缘周围巩膜浅层静脉环与分支，每眼光凝360°，约100个点，大鼠的平均眼压在建模7 d后维持在22 mmHg（1 kPa=7.5 mmHg）以上为造模成功。在造模后10 d，白皮杉醇低剂量组和白皮杉醇高剂量组大鼠分别给予100 mg·kg^-1和200 mg·kg^-1白皮杉醇灌胃，每天一次，共21 d。对照组不做任何处理，模型组只给予造模处理，不给予药物处理。
1.4　眼压测量　100 g·L^-1水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，于双眼滴入4 g·L^-1奥布卡因滴眼液一滴，用Tono-pen AVIA眼压计（美国Mentor公司）测量头迅速触碰角膜表面，读数，每眼测量4次，取平均值。分别测量建模前及建模后3 d、7 d和10 d眼压。
1.5　标本的制备　给药完成后，100 g·L^-1水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，4 g·L^-1奥布卡因滴眼液滴眼2次，迅速分离眼肌，摘取眼球，氯化钠盐水冲洗后置40 g·L^-1多聚甲醛中固定30 min，沿角膜缘去除角膜，去除晶状体和玻璃体，继续固定12 h。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片后冷冻备用。
1.6　荧光金逆行标记　造模完成后当天，俯卧固定，于颅顶正中切开皮肤，以前囟点为0点，后移6.5 mm，中线两侧1.5 mm处用牙科钻钻两个孔，将0.8 μL 50 g·L^-1荧光金匀速注入，止血，缝合^［7］。
1.7　RGCs计数　将视网膜铺片于倒置荧光显微镜下观察，以视盘为中心，将视网膜分为颞上、颞下、鼻上、鼻下四个象限，每个象限距视盘中心1 mm、2 mm、3 mm各选3个区域进行荧光拍照，计数每个视野视网膜上标记的RGCs数目，计算12个区每个视野平均计数，即为整个视网膜的RGCs密度。
1.8　HE染色　将石蜡切片置于二甲苯中脱蜡，依次浸泡于梯度乙醇（体积分数100%、95%、85%、70%）各3 min，苏木素染色10 min；洗去多余染液，体积分数0.5%盐酸酒精分色，伊红染色5 min；依次浸泡于梯度乙醇（体积分数70%、85%、95%、100%），二甲苯透明，中性树胶封片。置于显微镜下观察。
1.9　免疫印迹法　将视网膜剪碎，在冰上匀浆，加入裂解液裂解30 min，4 ℃12 000 r·min^-1离心5 min，取上清液，进行蛋白定量，加入上样缓冲液，上样至SDS-PAGE胶，进行电泳，电泳完成后转膜，加入100 g·L^-1脱脂奶粉后室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，洗涤，加入相应二抗室温孵育1 h，洗涤，化学发光法显色，成像扫描分析系统保存图像。
1.10　统计学分析　所有数据均采用SPSS 19.0统计软件进行分析，实验结果以均数±标准差(x?±s)表示，各组均数间两两比较采用Bonferroni校正的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　眼压的变化　建模前小鼠眼压为（12.14±2.35） mmHg，而建模后3 d增加至（24.35±7.11）mmHg，在建模后7 d眼压达到最高值，为（28.35±5.33） mmHg，并在10 d时趋于稳定（26.19±6.09） mmHg，提示建模成功。
2.2　RGCs变化　给药完成后，对照组、模型组RGCs分别为（191.55±34.57）个/视野、（96.67±25.86）个/视野，与对照组相比，模型组RGCs明显降低（t=4.631，P=0.001）；白皮杉醇低剂量组和白皮杉醇高剂量组分别为（134.41±25.36）个/视野、（81.43±30.51）个/视野，均显著高于模型组（t=3.124，P=0.003；t=3.674，P=0.002），均低于对照组（t=1.895，P=0.012；t=1.216，P=0.043）。白皮杉醇低剂量组高于白皮杉醇高剂量组（t=2.024，P=0.029，见图1）。
2.3　各组大鼠视网膜HE染色结果　光镜下，对照组大鼠视网膜的结构清晰，RGCs单层排列；与对照组相比，模型组大鼠RGCs明显减少，可见空泡和水肿样改变；与模型组相比，白皮杉醇低剂量组大鼠RGCs减少，可见少量空泡和水肿样改变，RGCs排列稍紊乱；与模型组相比，白皮杉醇高、低剂量组大鼠RGCs排列稍紊乱，偶见空泡和水肿样改变，其中高剂量组改善作用更为显著（图2）。
2.4　p-JNK和p-c-Jun蛋白表达变化　模型组大鼠视网膜组织中p-JNK蛋白表达显著高于对照组（P=0.002，图3）；白皮杉醇低、高剂量组大鼠视网膜组织中p-JNK蛋白表达均明显低于模型组（P=0.021、P=0.011），高于对照组(P=0.009、P=0.012)。模型组大鼠视网膜组织中p-c-Jun的蛋白表达显著高于对照组（P=0.001，图4）；白皮杉醇低、高剂量组大鼠视网膜组织中p-c-Jun的蛋白表达均明显低于模型组（P=0.026、P=0.022），高于对照组(P=0.034、P=0.029)；其中白皮杉醇低剂量组p-JNK和p-c-Jun的蛋白表达略高于白皮杉醇高剂量组，但差异均无统计学意义（P=0.226、P=0.104）。








2.5　p-ERK与p-p38 MAPK蛋白表达的变化　模型组大鼠视网膜组织中p-ERK与p-p38 MAPK蛋白表达均显著高于对照组（P=0.006、P=0.014）；白皮杉醇低、高剂量组大鼠视网膜组织中p-ERK均显著低于模型组（P=0.018、P=0.004），高于对照组（P=0.024、P=0.032）；p-p38 MAPK蛋白表达均显著显著低于模型组（P=0.031、P=0.024），高于对照组（P=0.028、P=0.037）；其中白皮杉醇低剂量组p-ERK与p-p38 MAPK蛋白表达均高于白皮杉醇高剂量组（P=0.035、P=0.032，图5）。
2.6　TNF-α蛋白表达的变化　模型组大鼠视网膜组织中TNF-α蛋白表达水平显著高于对照组（P=0.006）；白皮杉醇低、高剂量组大鼠视网膜组织中TNF-α蛋白表达均明显低于模型组（P=0.035、P=0.009），高于对照组（P=0.015、P=0.038）；其中白皮杉醇低剂量组TNF-α蛋白表达高于白皮杉醇高剂量组（P=0.034，图6）。
3　讨论
    青光眼属于视神经损害，是以视野缺损为特征的不可逆致盲性疾病^［8］。RGCs是视网膜中唯一的视觉输出神经元，RGCs受损是影响视力减退的重要原因。研究发现，白皮杉醇能够增加青光眼大鼠RGCs数量，提示白皮杉醇可能具有抑制青光眼RGCs凋亡的作用。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号通路是一类广泛存在并且高度保守的信号转导途径，而JNK、ERK与p38是三种不同的MAPK信号转导通路，它们是真核生物信号传递网络中的重要方式，在调控基因转录、蛋白表达、细胞周期、分化、转化与凋亡等一系列细胞生物学反应中发挥关键作用^［9-10］。当受外界刺激后，JNK产生磷酸化活化，磷酸化的JNK进入细胞核中后可使c-Jun磷酸化^［11］。c-Jun是JNK的主要下游因子，激活主要依赖于转录的凋亡信号通路。JNK激活后可刺激致炎因子TNF-α、IL-8含量的增多。有报道指出，在激光诱导的大鼠青光眼模型中，眼压升高2 d后p-JNK的表达显著增加，且RGCs的凋亡同样增加^［12］。当特异性抑制JNK的活性后，可降低紫外线诱导的视网膜色素上皮细胞的凋亡^［13］。本研究发现，模型组视网膜铺片的RGCs数量降低和大鼠视网膜组织中p-JNK、p-c-Jun和TNF-α蛋白均显著高于对照组（均为P<0.05）；白皮杉醇低、高剂量组视网膜铺片的RGCs增加，大鼠视网膜组织中p-JNK、p-c-Jun和TNF-α蛋白表达均明显低于模型组（均为P<0.05）。说明光凝诱导的大鼠青光眼RGCs凋亡的过程中激活了JNK/c-Jun信号通路，使大鼠视网膜组织JNK磷酸化活化，引起下游c-Jun磷酸化和TNF-α表达增高，使得RGCs发生凋亡；给予白皮杉醇治疗后，白皮杉醇能够抑制JNK的活化，进而抑制其下游因子c-Jun和TNF-α的表达，有效地降低RGCs的凋亡。另外，ERK通路和p38通路激活后能够促进细胞质靶蛋白磷酸化，参与细胞凋亡、增殖等生物学反应^［14］。本研究发现，模型组大鼠视网膜组织中p-ERK与p-p38蛋白表达水平均显著高于对照组（P=0.006、P=0.014），白皮杉醇低、高剂量组大鼠视网膜组织中p-ERK与p-p38均显著低于模型组（均为P<0.05），推测白皮杉醇可能抑制ERK与p38信号通路。这可能是白皮杉醇抑制青光眼RGCs凋亡的病理机制之一。
    综上所示，白皮杉醇具有保护青光眼RGCs的作用，作用机制可能与MARK信号通路有关。