《眼科新进展》  2017年6期 523-526   出版日期：2017-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
青蒿琥酯对人Tenon囊成纤维细胞增殖与凋亡的影响


    青光眼现已成为世界第一位的不可逆性致盲性眼病［1］。目前青光眼滤过术仍是临床上治疗青光眼的主要手术方式。青光眼术后滤过区瘢痕的形成将直接导致手术的失败，其主要是由于术后成纤维细胞的异常增殖、肌成纤维细胞的收缩以及细胞外基质的合成增多等引起［2］。青蒿琥酯(artesunate，Art)是青蒿素的衍生物，以往研究表明其具有治疗瘢痕及纤维化疾病的作用［3］，这为进一步研究其防治青光眼滤过手术区瘢痕的形成提供了有益的启示。本研究观察Art对人Tenon囊成纤维（human Tenon’s capsule fibroblasts，HTFs）细胞增殖与凋亡的影响，为探讨其作为青光眼滤过术后抗瘢痕形成的药物提供依据。
1　材料与方法
1.1　细胞来源　HTFs购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
1.2　主要试剂与仪器　Art（纯度＞99%，中国桂林南药股份公司）；DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国Hyclon公司）；胰蛋白酶、二甲基亚砜（美国Sigma公司）；MTT试剂盒（中国南京凯基生物有限公司）；细胞培养箱、ECL显色试剂盒（美国Thermo公司）；全波长多功能酶标仪(美国Eppendorf 公司)；Guava EasyCyte 流式细胞仪、AnnexinV PE-7-AAD凋亡试剂盒(德国Merck Millipore 公司)；Bax、Bcl-2兔抗人单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔及抗鼠IgG 单抗(美国CST公司)；β-actin鼠抗人单克隆抗体(中国碧云天生物技术研究所)；BCA蛋白定量试剂(中国北京康为世纪生物科技有限公司)；凝胶成像系统(美国Bio-rad公司)。
1.3　方法
1.3.1　HTFs细胞的培养　将细胞培养在含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于含体积分数5%二氧化碳的37 ℃恒温培养箱中培养。及时换液处理，当细胞生长至培养瓶底的80%时给予 2.5 g·L-1胰蛋白酶消化并传代。取3~6代细胞用于实验。
1.3.2　MTT法检测HTFs细胞增殖　将处于对数生长期的HTFs细胞消化计数后接种于96孔板，实验分为空白对照组、Art处理组（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1），同时设置调零孔，每组每种细胞均设3个复孔，于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中培养24 h，换用含体积分数1％胎牛血清的DMEM培养基饥饿培养12 h。空白对照组继续加入含体积分数1％胎牛血清的DMEM高糖培养基，Art处理组按照规定的浓度加药。48 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，继续培养4 h，吸弃培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解，采用酶标仪测定各孔于560 nm波长下的吸光度（A）值。计算Art对HTFs细胞的生长抑制率，即生长抑制率=（1-处理组A/对照组A）×100%。
1.3.3　流式细胞仪检测HTFs细胞凋亡　细胞培养和实验分组同MTT法，空白对照组和Art处理组（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1）细胞培养48 h后，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤2次，制备受试样品细胞悬液。按说明书加入AnnexinV PE-7-AAD凋亡试剂盒中的试剂，避光，于室温静置反应20 min后行流式细胞仪检测。
1.3.4　Western blot检测HTFs细胞凋亡相关蛋白的表达　细胞培养和实验分组同MTT法，空白对照组和Art处理组（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1）细胞培养48 h后，收集各组细胞，置冰上裂解并提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。取等量的上样蛋白加入SDS凝胶中，电泳，电转印至PVDF膜上，待脱脂奶粉液封闭漂洗后，加入相应一抗（Bax、Bcl-2兔抗人单克隆抗体，β-actin鼠抗人单克隆抗体），4 ℃孵育过夜，第2天漂洗后用山羊抗兔及抗鼠辣根过氧化物抗体37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL显色，凝胶成像系统拍照，ImagJ软件测量蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参，分析目的蛋白的相对含量。
1.4　统计学分析　采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，结果以x?±s表示，计量资料比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　Art对HTFs细胞增殖的影响　MTT法检测结果示：Art处理组（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1）的A值与空白对照组相比，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；不同浓度Art组间差异亦均有统计学意义(均为P<0.05；见表1)。Art对HTFs细胞增殖呈浓度依赖性抑制，Art的浓度越高，对HTFs细胞的抑制率越高。



2.2　Art对HTFs细胞凋亡的影响　流式细胞仪检测结果示：Art处理组（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1）HTFs细胞总凋亡率与空白对照组相比，差异均有统计学意义(均为P<0.01)；不同浓度Art组间差异亦均有统计学意义（均为P<0.05；见表2、图1）。随着Art浓度的增加，HTFs细胞凋亡率显著增加。




2.3　Art对HTFs细胞凋亡相关蛋白Bax 和Bcl-2表达的影响　Western blot 检测结果示：与空白对照组相比较，Art处理组（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1）HTFs细胞中Bax蛋白的相对表达量均明显增多(均为P<0.01)；Bcl-2蛋白的相对表达量均明显减少(均为P<0.01)；且随着Art浓度的增加，Bax的表达显著增加，Bcl-2的表达显著减少（均为P<0.05；见表3、图2）。故推测HTFs细胞Bax、Bcl-2蛋白表达受Art浓度的影响。




3　讨论
    抗青光眼的滤过手术是目前青光眼的主要治疗手段，滤过泡的纤维瘢痕化是手术失败的主要原因。针对青光眼滤过手术后滤过泡的瘢痕化，临床工作者进行了多种多样的尝试。抗滤过泡瘢痕化的药物研究扩展到多方面，如免疫抑制剂、生物制剂等［4-7］，各类新药在安全性与有效性之间无法达到平衡。目前临床上对抗滤过泡瘢痕化的方法仍多采用术中抗代谢药物的局部浸润及术后糖皮质激素的应用，但其远期效果欠佳且并发症较多，例如结膜和角膜上皮毒性、薄壁或囊泡状滤过泡、滤过泡渗漏、滤过泡感染、持续性低眼压、浅前房等。
    青蒿素是我国科研人员于1972年从菊科植物黄花蒿叶中分离提取得到的具有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物［8］。因其毒性低、抗疟疾作用强，临床主要用于治疗疟疾，Art是其衍生物。随着对青蒿素及其衍生物研究的不断深入，人们发现其除传统的抗疟疾作用外，还具有多种其他药理作用：抗炎、抗病毒、抗纤维化、抗寄生虫、抗肿瘤、抗孕、抗瘢痕等［9-11］。作为新型抗纤维化药物，其对肺、肝、肾脏的作用已得到广泛研究［12-16］。
    青光眼滤过术后成纤维细胞的大量增生和转化，伴随着Ⅰ型胶原的合成和分泌增加，导致瘢痕的形成［2］。因此通过抑制成纤维细胞的增生，可以达到抑制滤过泡瘢痕形成的目的。本研究选取Art作用于体外培养的HTFs细胞，观察Art对HTFs细胞增殖与凋亡的影响。MTT法检测结果显示：50~200 μg·mL-1的Art对HTFs细胞增殖有抑制作用，且其抑制作用呈浓度依赖性(均为P<0.05)。迟寅秀等［10］研究发现Art对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，且呈浓度依赖性，本研究结果与其相似，Art的浓度越高，对HTFs细胞的抑制率越高。流式细胞仪检测结果显示：与空白对照组相比较，Art处理组（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1）的HTFs细胞凋亡率均明显增加，且随着Art浓度的增加，凋亡率显著增加(均为P<0.01)。Bax和Bcl-2蛋白是两个重要的凋亡相关蛋白，前者促进细胞凋亡，后者抑制细胞凋亡［17-18］。LINDSTEN等［17］研究发现，如果没有Bax的参与，则无法启动细胞凋亡，由此可见Bax在细胞凋亡中发挥着巨大的作用。本研究采用Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达，结果表明：与空白对照组相比较，Art处理组（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1）促进细胞凋亡的相关蛋白Bax的相对表达明显增多(均为P<0.01)，抑制细胞凋亡的相关蛋白Bcl-2的相对表达量明显减少(均为P<0.01)；且HTFs细胞Bax、Bcl-2 蛋白表达受Art浓度的影响，随着Art浓度的增加，Bax的表达显著增加，Bcl-2的表达显著减少。朱奔奔等［19］报道了Art对人胃腺癌细胞有诱导凋亡的作用，且随Art浓度增高细胞凋亡率逐渐升高，Bcl-2蛋白表达逐渐降低，Bax蛋白表达逐渐增高，本研究的实验结果与其不谋而合。故推测Art诱导HTFs细胞的凋亡，其机制可能是通过调控Bax和Bcl-2的表达而实现的，且随药物浓度的增加，其对凋亡相关蛋白表达的调控作用也明显增强。
    综上，本研究显示Art呈浓度依赖性地抑制HTFs细胞的增殖，其作用机制可能是通过调节凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达诱导HTFs细胞的凋亡，从而抑制其增殖实现的。因此Art极有可能成为预防和治疗青光眼滤过手术后滤过道纤维瘢痕化的新途径。但Art通过何种信号通路发挥作用等方面还需做进一步的研究。本实验为体外实验，条件易于控制，与机体内环境有一定差异，Art在体内的生物活性有待进一步证实。此外，Art应用的最佳作用浓度、最佳作用时间等仍有待进一步探讨。