《眼科新进展》  2017年6期 519-522   出版日期：2017-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
偶联穿膜肽携带外源蛋白进入眼球的研究


    随着医学及生物技术的发展，以抗体为代表的重组蛋白药物越来越多地出现在眼科的临床应用中。由于角膜屏障及血-眼屏障的存在，分子量大、结构复杂且渗透性较差的蛋白药物不论是通过传统的滴眼给药还是全身注射，都不能有效到达眼球内的病灶区，因此临床往往选择玻璃体内注射方式提高给药效率［1］。但是玻璃体内注射易引起玻璃体积血、视网膜脱离和眼内炎等并发症，患者接受度差，极易引起医患矛盾。因此，通过优化蛋白药物结构、剂型进而使其可以通过无创的给药方式作用于眼球，对推动蛋白药物的临床应用、提高眼科疾病的治疗成功率以及改善医患关系都有重要的意义。
    自1988年首次发现艾滋病毒上的转录反式激活蛋白Tat 具有穿透多种细胞膜的作用后，一系列通过耗能或非耗能形式跨过细胞膜结构的多肽相继被发现，这些具有共同生物学作用的多肽分子被统一命名为穿膜肽(cell penetrating peptides)［2-3］。穿膜肽不仅可以携带比起自身大100倍的蛋白穿透细胞膜进入细胞内部，而且具有不干扰所携带蛋白正常的生物学功能的能力。细胞穿膜肽研究的兴起为研究人员优化眼科蛋白药物提供了新的思路。在本研究中，我们将9聚精氨酸（R9）［4］作为穿膜肽和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）偶联后，探讨该重组蛋白是否具备无创进入到细胞和眼球内部的能力，为今后开发新型眼科用药提供新的思路。
1　材料与方法
1.1　材料　含有重组GFP、R9-GFP基因的表达菌株由东北农业大学生物制药教研室保存，人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cell，HLEC）由哈尔滨医科大学附属第一医院眼科医院刘平教授馈赠。
1.2　蛋白表达　本研究所涉及的重组蛋白均利用SUMO系统表达纯化。将转化连有目的基因（GFP、R9-GFP）表达载体的重组菌株活化后，加入异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）至终浓度为0.25 mmol·L-1进行重组蛋白的诱导表达，37 ℃ 继续培养6 h，离心收集菌体，收获的菌体以缓冲液A(含pH 8.0的50 mmol·L-1 磷酸三钠，150 mmol·L-1 NaCl，40 mmol·L-1 咪唑) 重悬，利用超声破碎菌体。4 ℃、12 000 r·min-1离心，留取细菌裂解上清。将裂解上清上样于5 mL Ni-NTA柱。上样完毕后，先用缓冲液A充分洗柱，后用缓冲液B(含pH 8.0的50 mmol·L-1 磷酸三钠，150 mmol·L-1 NaCl，400 mmol·L-1 咪唑)进行洗脱。将洗脱后得到的样品脱盐至PBS缓冲液中。提取融合蛋白后，将上述融合蛋白加入SUMO蛋白酶1后 4 ℃过夜酶切，酶切产物上样于PBS平衡过的Ni-NTA柱，流穿组分即为所需的目的蛋白。利用SDS-PAGE蛋白电泳检测目的蛋白的蛋白纯度及相对分子质量。
1.3　细胞培养　将冻存的HLEC复苏后转入100 mL培养瓶中，用含体积分数20%灭活胎牛血清的DMEM培养液在37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度条件下培养。当细胞形成细胞单层后，用2.5 g·L-1胰蛋白酶按1∶3比例传代，细胞密度为106个·mL-1，取对数生长期的细胞用于后续实验。
1.4　R9-GFP对HLEC活力的影响　将处于对数生长期的HLEC用2.5 g·L-1的胰蛋白酶消化后，在基础培养液中重悬，按每孔100×103个细胞接种于96孔板，常规培养24 h，待细胞密度达到90%时，分别将GFP和 R9-GFP按照不同稀释浓度梯度（1 mg·L-1、5 mg·L-1、25 mg·L-1）添加至HLEC细胞培养基中继续孵育2 h，未处理细胞为空白对照组。蛋白作用后，向各孔中加入MTT 20 μL，继续培养4 h后弃去上清液，加入二甲基亚砜溶液150 μL，轻轻振荡至固体颗粒完全溶解后，取反应液于全自动酶标仪上在490 nm波长处读取吸光度值，每组设6个复孔。计算各处理组细胞的相对增殖率，即相对增殖率=实验组平均A值/空白对照组平均A值。
1.5　流式细胞仪检测R9-GFP对HLEC的穿透作用　将5 mg·L-1、10 mg·L-1、15 mg·L-1的R9-GFP添加至HLEC细胞培养基中，以15 mg·L-1 GFP作为对照，蛋白孵育细胞2 h后行流式细胞仪检测。
1.6　显微镜下观察R9-GFP对HLEC的穿透作用　将HLEC接种在经多聚赖氨酸包被的盖玻片上，待其铺满玻片后换新鲜培养基，并加入终浓度为15 mg·L-1的R9-GFP共孵育，继续培养2 h时后弃去培养基，预冷PBS洗涤3次，每次5 min；40 g·L-1多聚甲醛固定10 min后PBS洗涤3次；体积分数50%甘油封片后于激光共聚焦显微镜下观察，15 mg·L-1 GFP作为对照。
1.7　裂隙灯观察　用生理盐水将GFP和R9-GFP配制成浓度为1 g·L-1的溶液，用直径0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后待用。购自北京维通利华的5周龄洁净级昆明小鼠18只，适应性喂养1周后，将小鼠随机分为3组，所有小鼠左眼滴用R9-GFP 100 μL，右眼滴用相同剂量的GFP，3组每天分别滴用3次、2次和1次，连续使用7 d。实验结束后，将3组小鼠用70 g·L-1 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(5 mL·kg-1)，麻醉效果满意后一人手持小鼠放于裂隙灯显微镜前方，用手指牵拉脸部以充分暴露眼球；另一人操作裂隙灯显微镜以弥散光照明法检查双眼眼前节状况。
1.8　R9-GFP对眼球屏障穿透能力的研究　眼前节照相完成后断椎法处死小鼠，取眼球行ELISA检测。即眼球用预冷PBS清洗3次，液氮研磨，利用蛋白裂解液提取蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，P0012）将抗GFP的多克隆抗体包被于96孔板，4 ℃ 过夜。PBST洗3次，每次2 min，50 g·L-1脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，洗涤后，加50 mg·L-1 蛋白提取液100 μL，于37 ℃下孵育1 h，洗涤后加入鼠抗GFP一抗（阴性对照加等量PBS），孵育洗涤同上。再加入HRP-羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，洗涤后，加入TMB底物液，于37 ℃避光显色5 min，每孔加入 50 μL 终止液（2 mol·L-1的H2SO4），用酶标仪在波长450 nm下检测其OD值。
1.9　统计学方法　采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料用x?±s表示，多个样本均数之间的比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　重组蛋白的表达及纯化　SDS-PAGE蛋白电泳检测结果示，本研究成功获得了高纯度的两个重组蛋白（图1），可以用于后续实验。
2.2　R9-GFP对HLEC的穿透作用　流式细胞仪检测结果显示，R9-GFP处理后的HLEC均可以检测到荧光信号，而GFP处理组均无信号检出。R9-GFP信号强度与蛋白作用剂量呈剂量依赖性变化（图2）。




该结果说明R9-GFP能够有效进入细胞内。
2.3　R9-GFP对HLEC活性的影响　MTT结果显示，与GFP处理组相比，R9-GFP处理的HLEC细胞活力没有变化（P>0.05；图3），证明该蛋白对细胞活力没有影响。
2.4　R9-GFP穿膜活性的显微镜观察　激光共聚焦显微镜下可见单独GFP没有进入细胞内部的能力，而R9-GFP（绿色）可以进入细胞内部（图4）。
2.5　R9-GFP穿透眼球屏障能力的检测　ELISA检测结果显示（图5），每天3次给药组R9-GFP检出量显著高于GFP对照组。
2.6　重组蛋白对眼球生理状态的影响　裂隙灯观察结果示，滴用GFP和R9-GFP 7 d后的小鼠角膜均透明，屈光间质均清晰，眼部均未发现异常（图6）。






3　讨论
    目前已经证实有效地将多肽类药物等导入细胞内的手段有电穿孔［5］、显微注射［6］、洋地黄皂苷处理法［7］、成孔蛋白质法［8］以及利用病毒载体［9］导入类膜结构颗粒(如脂质体等)［10］。与穿膜肽相比，上述方法均存在导入率低、易造成细胞损伤甚至死亡等缺点，目前这些方法仅在科研领域使用，临床上鲜有

使用报道。相比之下，细胞穿膜肽显然具有很大优势：穿膜肽对细胞膜的亲和性高、穿膜速度快，最重要的是对细胞膜没有破坏性。将它们作为生物活性分子的细胞内转运工具应用于细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价等领域，具有诱人的前景。在首个穿膜肽发现以来，已有多篇文章证实细胞穿膜肽可增加多肽类药物的口服［11］、肺部［12］、肠道［13］给药的吸收及生物利用度，基于细胞穿膜肽所开发的多肽药物及给药方式国内也有所研究［14］。未来几十年里对于多肽类药物稳定性及体内转运方面的研究将是整个生物医药领域的发展趋势，而细胞穿膜肽必将是其中的研究热点之一。
    众所周知，眼球是一个相对封闭的球体，存在眼球屏障以保持内外环境的稳定性。眼球屏障由角膜屏障和血-眼屏障（包括血-房水屏障和血-视网膜屏障）构成，对于很多药物而言，局部滴眼给药后，受角膜屏障和血-眼屏障、血浆蛋白结合等因素影响，进入眼底部位如视网膜或脉络膜组织的药量很少，很难达到治疗浓度，目前临床上主要采取玻璃体内注射的方式。因此，寻找一种理想的能穿透眼球屏障的药物，使其通过局部滴眼给药后到达眼底发挥疗效将会极大地提高患者的接受程度，从而更好地达到治疗目的。本实验结果表明，R9修饰后的蛋白，其穿透性能得到良好改善。通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测，证明R9可以将外源蛋白带入HLEC内部，甚至可以达到细胞核内。此外，动物实验表明，通过滴眼给药方式，该穿膜肽可以将外源蛋白带入眼球内部。
    当然，由于条件所限，本研究尚不能证实R9具体可以把外源蛋白带到眼球的什么部位和带入剂量。而且由于绝大多数细胞穿膜肽自身没有靶向性，如此便会造成应用时的针对性不足，药物分布过于宽泛而导致局部有效剂量降低和药物的浪费。但是本研究证实R9能够携带外源物质穿透眼球屏障到达眼球内部，已经达到了现阶段我们的预期目的。这一研究对探索大分子蛋白质眼部给药的新途径具有重要意义。未来开发具有组织器官靶向性、可胞内定位的细胞穿膜肽类药物并配合合适的剂型将是以细胞穿膜肽为载体的穿膜蛋白药物的主要研究方向。