《眼科新进展》  2017年6期 515-518   出版日期:2017-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
硫化氢对H2O2诱导的视网膜神经节细胞氧化损伤的保护作用


    大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)含有丰富的能产生活性氧的线粒体。在高眼压或低氧状态下,细胞清除活性氧的能力下降,直接或间接损伤线粒体膜,降低线粒体膜电位并促进细胞色素C释放和Caspase-3激活,导致细胞凋亡[1-2]。硫化氢是一种重要的气体信号分子,可以中和超氧阴离子、H2O2[3]、过氧硝酸盐[4]及次氯酸盐[5]等氧化还原体系。研究表明,硫化氢作为一种强效的抗氧化剂是通过保护线粒体功能来防止心脏平滑肌和神经细胞遭受氧化应激损伤的[6]。在视网膜缺血再灌注前用硫化氢预处理,可以显著减少细胞色素C的释放并下调Caspase-3的表达[7]。目前,有关硫化氢保护RGC的线粒体通路机制仍然不清楚。本研究中,我们通过检测硫化氢预处理后RGC-5视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)表达、线粒体膜电位以及线粒体形态学等方面的变化,来探讨硫化氢在H2O2诱导的RGC-5氧化损伤中的保护作用及其可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验分组 将RGC-5分为4组,RGC-5组为正常对照组;RGC-5+H2O2组:RGC-5在500 μmol·L-1H2O2中培养24 h诱导氧化损伤[8];RGC-5+NaHS+H2O2组:RGC-5置于50 μmol·L-1NaHS中30 min后在500 μmol·L-1H2O2中培养24 h;RGC-5+NaHS组:RGC-5置于50 μmol·L-1 NaHS中30 min。
1.1.2 试剂及仪器 RGC-5(广州莱德尔生物科技有限公司);体积分数10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 μg·mL-1链霉素、DMEM高糖培养基、PBS液(Hyclone公司);OPA1蛋白(美国Epitomics公司);JC-1荧光探针(Beyotime公司);10 g·L-1锇酸固定液、30 g·L-1醋酸铀-枸橼酸铅(上海抚生实业有限公司);细胞线粒体分离试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);二氧化碳培养箱(深圳爱特尔电子科技有限公司);倒置荧光显微镜(德国Leica公司);透射电镜(美国FEI公司)。
1.2 方法
1.2.1 RGC-5的复苏及培养 将水浴锅预热至37 ℃,取出冻存管迅速解冻,投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻后将细胞转移至15 mL离心管内;在低速离心机上,以800 r·min-1离心5 min;吸去上清液,用1 mL培养基重悬细胞;将细胞悬液分装入培养皿内,放入37 ℃、含体积分数5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱内培养。
1.2.2 细胞色素C和OPA1的检测 取1.0~2.5 mL线粒体分离试剂加至20×106~50×106个细胞中,轻轻悬浮细胞,冰浴放置10~15 min,匀浆后离心,沉淀为细胞线粒体,再次离心上清液后取出,即为去除线粒体的细胞浆蛋白。Western blot检测线粒体内和去除线粒体的细胞浆内细胞色素C和OPA1蛋白。
1.2.3 线粒体膜电位检测 将不同处理的细胞收集在6孔板中,用PBS液洗涤2次,并加到1 mL无血清DMEM培养基中,然后注入1 mL 10 μg·mL-1 的JC-1荧光探针染色工作溶液。红色荧光代表JC-1线粒体聚集,表明高线粒体膜电位。绿色荧光代表JC-1的单体形式,表明线粒体膜电位的耗散。
1.2.4 线粒体形态检测 RGC-5细胞用10 g·L-1锇酸固定液固定2~3 h,包埋固定后切成50~60 nm超薄切片,30 g·L-1醋酸铀-枸橼酸铅双染色后用透射电镜观察线粒体形态。
1.3 统计学处理 所有实验均重复检测3次。用SPSS 17.0中的One-Way ANOVA进行组间差异比较,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞色素C的表达 与RGC-5组相比,RGC-5+H2O2组中RGC-5细胞质内细胞色素C表达增加,而线粒体内的细胞色素C表达减少(均为P<0.05)。RGC-5组和RGC-5+NaHS+H2O2组RGC-5线粒体内、外细胞色素C的表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。RGC-5+NaHS组RGC-5细胞质内细胞色素C表达减少,而线粒体内的细胞色素C表达增加(均为P<0.05,见图1)。



2.2 OPA1的表达 与RGC-5组相比,RGC-5+H2O2组RGC-5细胞质内OPA1表达显著增加,而线粒体内OPA1表达减少(均为P<0.05)。RGC-5+NaHS+H2O2组和RGC-5+NaHS组RGC-5线粒体内、外OPA1的表达与RGC-5组相似,差异均无统计学意义(均为P>0.05,见图2)。
2.3 线粒体功能和形态的变化 红色和绿色的相对荧光比例代表膜电位的变化,比值越高表明膜电位越高。RGC-5+H2O2组线粒体膜电位与其他3组比较明显下降,其余3组间线粒体膜电位比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05,见图3-图4)。RGC-5+H2O2组线粒体肿胀呈球状,而其余3组线粒体肿胀不明显(图5)。






3 讨论
    RGCs凋亡是青光眼等致盲性眼病最主要的病理改变。而氧化应激是导致其凋亡或功能障碍的主要因素[9]。本研究中我们分析了硫化氢对H2O2诱导的RGC-5氧化损伤细胞线粒体膜电位和线粒体形态改变的影响,结果表明硫化氢能减少H2O2诱导RGC-5细胞线粒体膜电位的降低和线粒体肿胀。硫化氢能在RGC-5细胞受到氧化应激损伤时起到保护作用。
    细胞色素C是重要的细胞凋亡激活因子[10]。有研究表明,在视网膜缺血再灌注前硫化氢预处理,可以显著减少细胞色素C从线粒体内释放[7],减少细胞凋亡。
    线粒体途径是细胞凋亡的主要途径和中心环节。OPA1 蛋白位于线粒体膜间隙处,参与线粒体内膜融合,对维持线粒体形态、功能有重要作用[11]。该蛋白过度表达会促进线粒体网络化或在细胞核旁聚集成束;抑制OPA1蛋白表达则导致线粒体片段化及线粒体嵴紊乱[12],线粒体膜电位耗散,而后细胞色素C 释放[13]。本研究发现,OPA1在线粒体内、外的分布变化与细胞色素C一致,即H2O2处理后RGC-5线粒体中细胞色素C与OPA1显著下降、同时出现线粒体膜电位异常,线粒体肿胀。而RGC-5细胞经过硫化氢预处理后,OPA1在线粒体内、外分布接近正常对照组并维持线粒体形态和线粒体膜电位不变。由此,我们推测硫化氢预处理可以阻止OPA1从

线粒体释放到细胞质内,维持线粒体内OPA1,从而维持线粒体膜电位以及减轻线粒体水肿,抑制细胞色素C释放,减少细胞凋亡。
    本研究结果表明,H2O2可以导致OPA1从线粒体内大量释放进入细胞质,破坏线粒体结构和功能。然而,硫化氢预处理可以通过调节OPA1的分布,维持线粒体的形态和功能,阻止细胞色素C从线粒体内外流,最终减轻H2O2对RGC-5的氧化应激损伤。推测硫化氢可以通过调节OPA1表达及分布保护线粒体功能和形态以减轻H2O2对RGC-5的氧化损伤。硫化氢调节OPA1释放的分子机制仍需进一步研究。