《眼科新进展》  2017年6期 511-514   出版日期：2017-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
脂联素对RF/6A细胞增殖、迁移及管腔形成的影响


    血管生成（angiogenesis）是指原位细胞发生增生、移行，形成新的血管的过程［1］。血管生成是器官发育所必需的生理过程，在组织修复及缺血再灌注损伤中发挥关键的保护性作用。然而，也常见于眼部新生血管等一些病理状态，例如脉络膜新生血管、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变等，继而导致视力障碍，影响患者生活质量。
    脂联素（adiponectin，APN）是1995年发现的主要由脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性蛋白质，也是分泌最多的脂肪因子，其相对分子质量为30 000［2］。研究表明，脂联素具有改善胰岛素抵抗、间接提高肝脏胰岛素敏感性、抑制动脉粥样硬化保护心血管系统以及抗炎的特性［3-4］，循环中APN水平较低被认为是内皮细胞受损、影响血管壁重塑的独立危险因素［5］。
    研究证实，APN及其受体在人眼组织中广泛表达［6］，且APN与眼部新生血管性疾病的关系十分密切［7］，但APN在脉络膜和视网膜血管形成过程中的作用尚待研究。基于此，本研究以猴视网膜/脉络膜内皮细胞（RF/6A）为研究对象，观察APN对细胞增殖、迁移、管腔形成的影响，以期为进一步研究APN在脉络膜和视网膜新生血管形成中的作用提供基础。
1　材料与方法
1.1　主要试剂　RF/6A细胞系（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）；DMEM培养液（美国GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶，二甲基甲酰胺DMF，二甲基亚砜DMSO，噻唑蓝MTT试剂盒（北京索莱宝生物技术有限公司）；基质胶Matrigel（美国BD公司）；重组APN（美国RD公司）。
1.2　实验方法
1.2.1　细胞培养及分组　将RF/6A细胞置于 37 ℃、体积分数5% CO2、95%湿度的培养箱，在含体积分数10%胎牛血清和抗生素的DMEM培养液中常规培养。3～4 d时细胞可铺满培养瓶底，按1∶3的比例传代，每天显微镜下观察细胞状态，取处于对数生长期、生长状态良好的细胞进行实验。将细胞随机分为对照组（加入PBS液）、不同浓度重组APN（rAPN）组（不含血清的DMEM培养液隔夜饥饿培养后分别加入5 pg·mL-1、50 pg·mL-1、500 pg·mL-1 rAPN预处理1 h）。
1.2.2 细胞增殖　采用MTT法检测细胞增殖能力。取对数生长期细胞，弃上清液，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，制成细胞浓度为50×103个·mL-1的细胞悬液。取200 μL接种于96孔板，孵育24 h后弃原培养液，按上述方法分4组，每组设置6个复孔，然后将培养板置于37 ℃、体积分数5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。培养24 h时，每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，置于培养箱中继续孵育4 h，弃去各孔培养液，每孔加入200 μL的DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。用自动酶标仪（美国Bio-Rad公司，680型）在490 nm波长处测定每孔的吸光度值A。每组重复检测3次。
1.2.3　细胞迁移　采用细胞划痕法检测细胞迁移能力。将RF/6A细胞按照每孔200×103个接种于6孔板中，待细胞贴壁生长至约90%融合时，用移液枪尖垂直培养板划一条直线，用PBS轻轻漂洗3次去掉漂浮细胞，形成一个无细胞的“裸区”。按上述分组分为4组。每组设3个平行孔，在倒置相差显微镜下拍照记录，作为0 h监测点。放入37 ℃的培养箱孵育24 h后再次照相。采用Photoshop图像处理软件进行图像分析，计算进入无细胞“裸区”的细胞面积（像素）［8］。实验重复3次。
1.2.4　细胞管腔形成　采用基质胶（Matrigel）法检测细胞血管管腔形成。将Matrigel胶在4 ℃条件下融化过夜，预冷96孔板和枪头。在超净工作台中，取96孔板，每孔内缓慢加入80 μL液态Matrigel胶（冰上进行），低速无菌离心除去气泡。37 ℃孵育30~60 min，使Matrigel胶凝固；按上述分组加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，将RF/6A细胞稀释为200×103个·mL-1的细胞悬液，每组加入50 μL。孵育24 h后在倒置相差显微镜下观察，随机取5个放大200倍的视野照相，对形成的完整管腔进行计数，取平均值。每组设3个复孔，实验重复3次。
1.3　统计学处理　采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（x?±s）表示，多组间均数的比较采用方差分析，两组间比较采用SNK法，将P<0.05视为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　APN对RF/6A细胞增殖能力的影响　MTT结果显示，培养24 h不同分组细胞的吸光度值A分别为：对照组0.52±0.01、5 pg·mL-1 rAPN组0.37±0.02、50 pg·mL-1 rAPN组0.29±0.04、500 pg·mL-1 rAPN组0.18±0.05。每两组间A值的差异均具有统计学意义（t=7.052、9.125、8.903、9.377、7.092，P=0.034、0.017、0.022、0.008、0.025）。相对于对照组，各浓度rAPN组24 h检测A值均降低，且随着rAPN浓度的增加而降低。提示APN对RF/6A细胞增殖具有抑制作用，高浓度APN对细胞的抑制作用进一步提高。
2.2　APN对RF/6A细胞迁移能力的影响　细胞划痕法实验结果显示，培养24 h后，大量细胞迁移入细胞划痕区。培养24 h不同分组RF/6A细胞的迁移面积（像素）分别为：对照组42 356±1988、5 pg·mL-1 rAPN组39 253±2720、50 pg·mL-1 rAPN组25 964±2114、500 pg·mL-1 rAPN组17 862±1062。与对照组相比，各浓度rAPN组RF/6A细胞迁移面积明显减少，高浓度rAPN组细胞迁移面积明显低于低浓度组，且每两组间细胞迁移面积的差异均具有统计学意义（t=8.347、7.016、7.751、9.045、8.108，P=0.031、0.039、0.028、0.009、0.014），提示APN可抑制RF/6A细胞的迁移能力（图1）。
2.3　APN对RF/6A细胞管腔形成能力的影响　Matrigel实验结果显示，不同分组RF/6A细胞形成的完整管腔数分别为：对照组（15.2±4.3）个、5 pg·mL-1 rAPN组（10.4±3.6）个、50 pg·mL-1 rAPN组（5.2±1.6）个、500 pg·mL-1 rAPN组（2.4±1.3）个，每两组间比较差异均具有统计学意义（t=7.005、6.934、7.042、9.086、9.553，P=0.038、0.042、0.031、0.011、0.006）。高浓度rAPN组管腔形成数低于对照组和低浓度rAPN组，且管腔形成数随着rAPN浓度的增加而减少。提示APN能够抑制RF/6A细胞管腔的形成（图2）。




3　讨论
    虽然新生血管的发生是机体的一种保护性反应，但它也是许多缺血性视网膜病变和脉络膜病变的共同病理改变和临床表现，是涉及多种细胞因子和复杂信号通路相互作用的复杂过程［9］。新生血管继发的眼部病变，如玻璃体积血、增殖性视网膜病变及新生血管性青光眼等均可导致严重的视力丧失。目前，针对眼部新生血管，激光，抗新生血管药物和玻璃体切割手术虽然具有一定的疗效，但全世界尚未获得完全安全和有效的治疗方法。因此，研究视网膜和脉络膜新生血管的病理机制和治疗方法已经成为了眼科的研究热点之一。
    APN作为一种新发现的脂源性激素，其结构、基因多态性及生物学作用已逐渐阐明。近年来研究发现，APN与多种疾病关系密切，如高血压、糖尿病、肿瘤、慢性阻塞性肺病、脑梗、心血管疾病及自身免疫性疾病等［10-12］。目前有很多关于APN与血管生成关系的研究，但得出的结果却大相径庭。OUCHI等［13］发现，APN通过AMPK-eNOS途径在体外可以诱导内皮细胞的血管生成。SHEN等［14］在APN过表达的小鼠大脑中发现，APN可以起到缺血损伤的保护作用，而该保护作用与涉及VEGF和AMPK途径的局部血管生成有关。然而，其他研究组却发现APN具有抑制内皮细胞血管生成事件，包括细胞迁移和增殖的潜能，主要涉及MAPK和cAMP-PKA信号途径［15］。有学者在抑制肿瘤生长的实验中发现，APN能降低细胞内Rho激酶/IFN诱导蛋白10信号转导，减少基质金属蛋白酶-9的分泌，从而间接地抑制肿瘤和肿瘤血管生长［16］。以上研究都侧重于APN对血管内皮细胞的作用，实验结果的不同可能与APN的浓度、内皮细胞类型以及体外微环境存在不同等多种原因有关。虽然APN对血管生成的影响和有关机制仍不十分明确，还需要更多研究予以证实，但随着研究的深入，APN有望成为一种新的抗血管生成药物。
    VIDHYA等［6］发现APN及其受体表达于多种眼部组织，包括分离的原代眼内细胞系中，提示APN在眼部生理和病理中发挥作用。BORA等［17］发现，APN表达于脉络膜组织，在实验小鼠模型中腹腔注射APN，可以抑制78%激光诱导的脉络膜新生血管。临床研究也发现，增生型糖尿病视网膜病变患者的房水和玻璃体中，APN的水平是明显升高的［7，18］。在小鼠氧诱导视网膜病变模型中，腹腔注射重组鼠APN蛋白在疾病进程中发挥视网膜血管的保护作用，即减少小鼠视网膜中央无血管区面积，并减少病理性新生血管的数目。进而发现，该作用机制为APN可激活内源性eNOS促进生理性NO生成，同时又能抑制ROS/RNS 的产生［19］。与上述眼部新生血管的研究相似，本研究也证实了APN与视网膜和脉络膜新生血管的发生存在关联，APN可明显抑制RF/6A细胞的血管生成过程，包括细胞增殖、迁移和管腔形成，且这种抑制作用随着APN浓度的增加而增强。
    综上所述，本研究首次采用体外实验证实APN可抑制RF/6A细胞的血管生成过程，但具体分子机制值得进一步研究。由于APN对血管内皮细胞的作用在体内外实验中有较大差距，还需要更多的基础和临床研究证实。此外，虽然RF/6A细胞作为脉络膜-视网膜细胞系被广泛用于脉络膜和视网膜新生血管的体外研究中，但是脉络膜与视网膜内皮细胞是不同的细胞类型，常常表现出非常大的分子差异性，且对外界刺激，例如生长因子和抗新生血管药物的反应不同［20-21］，因此需要进一步分别采用脉络膜和视网膜内皮细胞进行相应疾病的研究。