《眼科新进展》  2017年6期 506-510   出版日期：2017-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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白血病抑制因子（LIF）对视网膜视锥细胞氧化损伤的保护作用及机制


    随着我国人口老龄化的加快，视网膜色素变性、干性年龄相关性黄斑变性等视网膜退行性眼底疾病的发病率有明显上升趋势，已成为视力损害和致盲的常见原因^［1-2］。研究表明，长时间的氧化损伤是视网膜退行性病变的高危因素之一^［3］。白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）具有广泛的生物学作用，其在光损伤和遗传性视网膜退行性病变等动物模型中对视网膜光感受器的保护作用日益得到证实^［4-5］，但对视锥细胞氧化损伤的作用国内外罕见报道。本研究通过建立小鼠视锥细胞（661 W细胞株）氧化损伤模型，探讨LIF对视锥细胞氧化损伤的作用及其作用机制，为LIF成为治疗视网膜退行性病变的可行性药物提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料　Dulbecco 改良Eagle培养基（DMEM培养基）；胎牛血清、胰蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA）、HRP标记山羊抗兔二抗购自美国Sigma公司；兔抗小鼠多克隆STAT3抗体、兔抗小鼠多克隆p-Tyr705-STAT3抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量试剂盒、蛋白质Marker购自美国Thermo Fisher公司；MTT试剂盒购自美国ATCC公司；实时荧光定量PCR试剂盒PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqII染料法荧光定量试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；S3I201购自加拿大Calbiochem公司；LIF购自英国Abcam 公司。
1.2　方法
1.2.1　小鼠视锥细胞的培养　小鼠视锥细胞（661 W细胞株）购自美国ATCC公司，采用含体积分数10%胎牛血清的低糖型DMEM培养液，于37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养。待细胞生长融合至80%~90%时，用含0.5 g·L^-1胰蛋白酶与0.2 g·L^-1 EDTA（约2∶1）的消化液按1∶2~1∶4传代，取2~5代生长良好的传代细胞用于实验。将同代细胞随机分组，根据实验目的不同进行不同的细胞处理。
1.2.2　氧化损伤模型的建立　采用含1 mmol·L^-1 H₂O₂的无胎牛血清低糖型DMEM对661 W细胞进行干预，以建立氧化损伤模型，其中MTT实验中干预细胞12 h，Western blot和实时荧光定量PCR实验中干预细胞15 min。
1.2.3　实验分组　生长良好的661 W细胞传代后随机分为7组：（1）正常对照组：不加任何干预；（2）LIF干预组：仅加入5 ng·mL^-1 LIF对661 W细胞干预1 h；（3）H₂O₂干预组：仅加入1 mmol·L^-1 H₂O₂对661 W细胞进行干预；（4）S3I201干预组：仅加入50 μmol·L^-1 S3I201对661 W细胞干预1 h；（5）H₂O₂+LIF干预组：先运用5 ng·mL^-1 LIF预处理661 W细胞1 h，再加入1 mmol·L^-1 H₂O₂干预；（6）H₂O₂+S3I201干预组：先运用50 μmol·L^-1 S3I201预处理661 W细胞1 h，再加入1 mmol·L^-1 H₂O₂干预；（7）H₂O₂+LIF+ S3I201干预组：先运用50 μmol·L^-1 S3I201预处理661 W细胞1 h，再加入5 ng·mL^-1 LIF干预1 h，然后加入1 mmol·L^-1 H₂O₂干预。
1.2.4　Western blot法检测STAT3蛋白表达及其磷酸化水平　661 W细胞接种于直径6 mL的培养皿内，观察细胞生长融合至80%时，无血清培养基DMEM培养1 h，然后根据实验分组进行不同药物干预。细胞药物干预达到规定时间点后，吸净实验细胞培养基后，用预冷的磷酸盐缓冲液漂洗2次。冰上刮取细胞，离心后将预冷的细胞裂解液加入细胞沉淀中。在4 ℃条件下，14 000 r·min^-1离心30 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。制胶，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，脱脂奶粉封闭，加入兔抗小鼠抗体一抗（STAT3 1∶1000，p-Tyr705-STAT3 1∶1000）4 ℃孵育过夜。PVDF膜缓冲液漂洗后，加入HRP标记的山羊抗兔二抗孵育（1∶5000）37 ℃孵育1 h，漂洗。Odyssey成像系统分析条带灰度值，以p-Tyr705-STAT3条带与STAT3条带灰度值之比作为p-Tyr705-STAT3蛋白的相对表达量。
1.2.5　MTT比色法检测细胞活性　661 W细胞接种于96孔板，接种密度为20×10³个·mL^-1，每孔200 μL。待细胞生长融合至70％时，无血清培养基DMEM培养1 h，然后根据实验分组进行不同药物干预。细胞药物干预达到规定时间点后，每孔加入10 μL MTT反应溶液（终浓度为0.5 mg·mL^-1），置于37 ℃培养箱内过夜。第2天弃去培养液，每孔加入100 μL 裂解反应溶液，室温避光放置2 h至结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定细胞的吸光度值，测定波长为570 nm，以空白孔调零，计算各组细胞存活率，即细胞存活率=（实验组A值-空白对照组A值）/对照组A值×100%。每组设5个复孔，实验重复3次。
1.2.6　实时荧光定量PCR检测bcl-2和bcl-xl mRNA的相对表达　bcl-2引物序列：上游：5’-ACAAGAGCAGATTGCCCTGGATGT-3’，下游：5’-ATTCCGCCGTATCCATTCTCCTGT-3’，产物长度100 bp；bcl-xl引物序列：上游：5’-GACAAGGAGATGCAGGTATTGG-3’，下游：5’-TCCCGTAGAGATCCACAAA-AGT-3’，产物长度124 bp。PCR反应程序：预变性（95 ℃、3 min），变性（95 ℃、30 s），退火（57 ℃、30 s），延伸（65 ℃、20 s），循环40次。计算各组细胞内bcl-2和bcl-xl的mRNA相对表达量，实验重复3次。
1.3　统计学分析　采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（x?±s）表示，采用单因素方差分析对均数进行比较，各组两两之间的差异采用Student’s-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　LIF对p-Tyr705-STAT3蛋白相对表达量的影响　与正常对照组相比，LIF干预组p-Tyr705-STAT3蛋白的相对表达量明显增加，约为正常对照组的13倍（P<0.05）；H₂O₂干预组p-Tyr705-STAT3蛋白的相对表达量也明显增加，约为正常对照组的7倍（P<0.05）；H₂O₂+LIF干预组p-Tyr705-STAT3蛋白的相对表达增加最为显著，约为正常对照组的20倍（P<0.05）。与H₂O₂干预组相比，H₂O₂+LIF干预组p-Tyr705-STAT3蛋白的相对表达量显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明，在正常和氧化损伤条件下LIF均可激活STAT3信号通路（图1）。
2.2　STAT3特异性抑制剂S3I201对STAT3信号通路的影响　与正常对照组相比，H₂O₂干预组p-Tyr705-STAT3蛋白的相对表达量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；H₂O₂+ S3I201干预组p-Tyr705-STAT3蛋白的相对表达量稍增加，差异无统计学意义（P>0.05）。与H₂O₂干预组相比，H₂O₂+S3I201干预组p-Tyr705-STAT3蛋白的相对表达量显著下降（P<0.05），抑制率达70％（图2）。结果表明，氧化损伤条件下，STAT3特异性抑制剂S3I201可有效阻断STAT3信号通路。






2.3　氧化损伤条件下LIF/STAT3信号通道对661 W细胞细胞活性的影响　与正常对照组相比，LIF干预组（95.2%±6.1%）和S3I201干预组（93.5%±6.5%）661 W细胞的细胞活性无明显变化，差异均无统计学意义（均为P>0.05），表明该浓度的LIF和S3I201本身对661 W细胞的细胞活性无明显影响。与正常对照组相比，H₂O₂干预组（51.2%±3.6%）661 W细胞的细胞活性显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与H₂O₂干预组相比，H₂O₂+LIF干预组（79.6%±5.3%）661 W细胞的细胞活性显著提高，差异有统计学意义（P<0.05）。与H₂O₂+LIF干预组相比，H₂O₂+LIF+S3I201干预组（59.4%±3.4%）661 W细胞的细胞活性显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）（图3）。结果表明，1 mmol·L^-1 H₂O₂干预可引起661 W细胞的氧化损伤；氧化损伤条件下LIF对661 W细胞具有保护作用，而阻断STAT3信号通道可显著削弱LIF对661 W细胞的保护作用。

2.4　LIF/STAT3信号通道对661 W细胞抗凋亡因子bcl-2和bcl-xl mRNA表达的影响　与正常对照组相比，LIF干预组、H₂O₂干预组和H₂O₂+LIF干预组bcl-2和bcl-xl的mRNA相对表达量均显著增加，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；与H₂O₂+LIF干预组相比，H₂O₂+LIF+ S3I201干预组bcl-2和bcl-xl的mRNA相对表达量均显著下降（均为P<0.05；见图4）。结果表明，氧化损伤条件下，LIF/STAT3信号通道可能通过刺激bcl-2和bcl-xl的mRNA表达发挥对661 W细胞氧化损伤的保护作用。

3　讨论
    黄斑区的视网膜光感受器细胞主要是视锥细胞，特别是黄斑中心凹仅有视锥细胞，它是维持形觉、色觉及立体视觉等中心视功能最重要的部位，也是人类视觉最敏锐的部位。一旦该区域发生病变，视功能将受到严重的损害，因此，对于视锥细胞氧化损伤的研究显得尤为重要。661 W细胞株是一种变种的视锥细胞，它是从SV40 T-抗原转基因小鼠视网膜上分离得到的，既能在体外增殖，又能表达正常视锥细胞含有的感光细胞特异性蛋白，而且对氧化损伤诱导的细胞凋亡与正常视锥细胞相似，因此661 W细胞株是一种可靠的体外研究视锥细胞的替代物^［6］。
    在视网膜氧化损伤情况下，视锥细胞的各种视色素通过吸收辐射光谱中特定波段的光子而被激发，在视觉生理变化过程中，其可激活体内氧化应激系统，产生一系列自由基。体内过量自由基诱发的脂质过氧化反应可造成视锥细胞功能受损、甚至凋亡。光感受器细胞是有丝分裂后细胞，它们的死亡将造成永久性的致盲。至今尚无维持或改善视网膜退行性病变的有效治疗方法，现主要通过抑制视网膜光感受器细胞凋亡而达到保护视网膜形态和功能的目的^［3］。由于神经因子在阻止和延缓神经退行性病变中发挥着巨大的治疗潜力，已成为视网膜光损伤研究的热点。
    LIF的相对分子质量为20 000，它是从鼠的成纤维细胞条件培养基中提纯的一种细胞因子。中枢神经系统损伤后，LIF可通过作用于神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞抑制神经损伤后感觉和运动神经元的凋亡，在损伤后神经元的存活中起重要作用^［7-9］。LIF对视网膜光感受器细胞的保护作用也日益引起研究者的关注。外源性LIF呈剂量依赖性保护视网膜的功能和形态，在光损伤和遗传性视网膜退行性病变动物模型中LIF均表达上调；基因敲除LIF极大地加速了遗传性视网膜退行性病变动物模型视杆细胞的凋亡，LIF是视杆细胞存活所必需的^［5-6］。本研究通过建立661 W细胞氧化损伤模型，探讨LIF在视锥细胞氧化损伤中的作用，结果表明，氧化损伤条件下LIF对661 W细胞具有保护作用。
    LIF通过与细胞表面LIFR β结合而发挥生物学效应^［10-12］。当LIF与LIFR β结合后，可激活结合于gp130细胞内近胞膜部分的JAK激酶，活化的JAK激酶催化gp130胞浆区的酪氨酸磷酸化，进而激活与gp130的磷酸化酪氨酸结合的信号转导及转录活化因子STAT3。我们通过对外源性LIF对正常和氧化损伤条件下661 W细胞的p-Tyr705-STAT3表达的影响进行检测，发现在正常和氧化损伤条件下LIF均可激活STAT3信号通路发挥生物学作用。我们运用STAT3特异性阻断剂S3I201阻断STAT3信号通路，对661 W细胞的活性进行检测发现，阻断STAT3信号通道可显著削弱LIF对661 W细胞的保护作用，这表明LIF/STAT3信号通道对661 W细胞具有直接保护作用。
    在氧化应激引起的损伤中凋亡扮演着重要角色^［13］。bcl-2基因家族是细胞凋亡的重要调控基因，在细胞凋亡的过程中处于调控机制的终末部分，在维持细胞生理性分化发育和细胞数量的动态平衡中发挥重要作用。该基因家族包含作用相反的两类基因，一类是抑制细胞凋亡的基因bcl-2、bcl-xl、bcl-w、bfl-1等，另一类是促进细胞凋亡的bax、bak、bok、bcl-Xs等。氧化损伤条件下，活化的STAT3形成同源二聚体可转移到细胞核内与靶基因的启动子结合，诱导靶基因的转录，发挥生物学作用。许多STAT3的靶基因已经被确定，其中包括抗凋亡因子bcl-2和bcl-xl。本研究发现，正常和氧化损伤条件下，LIF均可刺激抗凋亡因子bcl-2和bcl-xl的mRNA表达增加，阻断STAT3信号通道可显著削弱LIF诱导的661 W细胞bcl-2和bcl-xl的mRNA表达增加，因此我们推测，LIF/STAT3细胞通道可能通过刺激bcl-2和bcl-xl的表达发挥对661 W细胞氧化损伤的保护作用。
    综上所述，氧化损伤条件下，LIF对661 W细胞具有直接保护作用，可能通过STAT3信号通道刺激bcl-2和bcl-xl的表达增加而发挥其作用。这一结果为临床治疗视网膜退行性疾病提供了新的思路。相信随着研究的不断深入，LIF将会成为临床治疗视网膜疾病的重要神经保护剂。