《眼科新进展》  2024年3期 178-182   出版日期：2024-03-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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LncRNA HAGLR靶向miR-625-5p对脂多糖诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响


视网膜色素上皮（RPE）细胞处于神经视网膜、脉络膜之间，可维持光感受器存活、视网膜内环境稳定，参与血-视网膜屏障、黄斑免疫防御等，其病变可引起年龄相关性黄斑变性等视网膜病^［1-2］。因而明确RPE细胞损伤机制，有助于保护视网膜功能，以防视网膜疾病发生发展。长链非编码RNA（LncRNA）可通过染色体重塑、转录后加工等方式调节基因表达，其差异表达可调控眼部疾病发生发展。研究发现，LncRNA可调节RPE细胞生理功能，影响视网膜疾病发展进程^［3-4］。LncRNA HAGLR可与内源性RNA竞争性结合微小RNA（miRNA），在炎症反应、心肌细胞凋亡等过程中发挥调控作用^［5］。但LncRNA HAGLR与视网膜病变相关研究报道相对较少。StarBase预测显示，LncRNA HAGLR与微小RNA-625-5p（miR-625-5p）存在结合位点。但关于miR-625-5p对RPE细胞损伤的研究报道较少。因此，本研究旨在探讨LncRNA HAGLR是否可通过靶向调控miR-625-5p表达参与RPE细胞损伤过程，为揭示视网膜病变机制及临床治疗奠定实验基础。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）购自上海启达生物公司；脂多糖（LPS）购自上海碧云天生物公司；阴性对照（sh-NC）、HAGLR慢病毒短发夹RNA（sh-HAGLR）、阴性对照mimic NC序列（miR-NC）、miR-625-5p寡核苷酸模拟物（miR-625-5p mimics）、特异性寡核苷酸抑制剂阴性对照（anti-miR-NC）、miR-625-5p特异性寡核苷酸抑制剂（anti-miR-625-5p）购自广州锐博生物公司；pcDNA、pcDNA-HAGLR购自上海吉玛生物公司；双荧光素酶活性检测试剂盒、野生型载体（WT-HAGLR）、突变型载体（MUT-HAGLR）购自美国Promega公司；Trizol试剂、转染试剂Lipofectamine^TM 3000 Transfection Reagent购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化公司；凋亡检测试剂盒、蛋白裂解液购自江苏凯基生物公司；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）检测试剂盒购自上海酶研生物公司；兔抗人活化的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3（cleaved-Caspase 3）抗体、兔抗人活化的cleaved-Caspase 9抗体、内参GAPDH、二抗购自美国Santa Cruz公司。
1.2　方法　
1.2.1　实验分组
ARPE-19细胞采用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养，取对数生长期细胞接种于24孔板（每孔2×10⁵个），加入10 mg·L^-1 LPS孵育24 h^［6］，记为LPS组。设置正常培养的ARPE-19细胞作为Con组。采用脂质体转染法将sh-NC、sh-HAGLR、miR-NC、miR-625-5p mimics、sh-HAGLR+anti-miR-NC、sh-HAGLR+anti-miR-625-5p分别转染至ARPE-19细胞，用10 mg·L^-1 LPS孵育24 h，依次分别记为LPS+sh-NC组、LPS+sh-HAGLR组、LPS+miR-NC组、LPS+miR-625-5p组、LPS+sh-HAGLR+anti-miR-NC组、LPS+sh-HAGLR+anti-miR-625-5p组，各组处理完成后收集细胞并进行后续实验。
1.2.2　实时荧光定量聚合酶链反应
收集各组ARPE-19细胞后采用Trizol试剂提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，采用试剂盒标准三步法进行实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）扩增，LncRNA HAGLR以GAPDH为内参，miR-625-5p以U6为内参，采用相对定量法2^-ΔΔCt计算。
1.2.3　流式细胞术检测细胞凋亡率
取各组ARPE-19细胞加入预冷PBS洗涤，之后加入500 μL Binding Buffer悬浮液，4 ℃条件下细胞悬液转移至EP管，经1 500 r·min^-1离心5 min，PBS洗涤2次，加入200 μL结合缓冲液，加入5 μL Annexin V-FITC，振荡混匀，室温避光孵育15 min，加入10 μL PI染色液，振荡混匀，室温避光孵育10 min，加入400 μL结合缓冲液，涡旋振荡器中持续振荡10 min，过滤，应用流式细胞仪及应用Cellauest软件检测各组细胞凋亡率。
1.2.4　ELISA法检测炎症因子水平
收集各组ARPE-19细胞（4×10⁵个·mL^-1），取细胞悬液加入24孔板（每孔500 μL），经3 000 r·min^-1离心10 min后取上清液，采用ELISA法检测IL-6、IL-1β水平：收集各组细胞培养基，从冰箱中取出ELISA试剂盒，若试剂盒内洗涤液出现结晶吸出，需放入恒温水浴锅内溶解，取细胞培养于室温条件，经2 000 r·min^-1离心20 min，IL-6标准品稀释浓度：240、160、80、40、20、0 ng·L^-1，IL-1β标准品稀释浓度：120、80、40、20、10、0 ng·L^-1，设置不加样品孔与酶标试剂的空白对照孔，待测样品孔内加入样品稀释液40 μL、上清液10 μL，水浴锅升温至37 ℃，酶标板封板，置于37 ℃水浴锅内孵育30 min后检测。
1.2.5　双荧光素酶报告实验
采用StarBase预测显示LncRNA HAGLR、miR-625-5p存在结合位点，以结合位点为模板进行扩增，插入pmirGLO载体，分别构建WT-HAGLR、MUT-HAGLR，同时取对数生长期ARPE-19细胞接种于24孔板，将上述载体分别与miR-NC或miR-625-5p mimics共转染至ARPE-19细胞，48 h后收集细胞并检测荧光素酶活性。
1.2.6　Western blot检测cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白表达水平
收集各组ARPE-19细胞加入RIPA裂解液，冰上孵育30 min后离心取上清，采用BCA法检测蛋白浓度，蛋白变性5 min后行SDS-PAGE凝胶分离，转膜后采用脱脂奶粉（37 ℃）封闭90 min，加入cleaved-Caspase 3（1∶800）、cleaved-Caspase 9（1∶800）一抗、内参GAPDH抗体（1∶1 000）稀释液在 4 ℃ 条件下孵育过夜，次日加入二抗稀释液（1∶5 000）后室温下孵育90 min，显色曝光后应用ImageJ软件分析各条带灰度值。
1.3　统计学方法
采用SPSS 25.0软件分析数据，计量资料以x?±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　LncRNA HAGLR和miR-625-5p在LPS诱导的ARPE-19细胞中的表达
Con组、LPS组LncRNA HAGLR表达水平分别为1.00±0.00、3.71±0.29，miR-625-5p表达水平分别为1.00±0.00、0.42±0.05，与Con组比较，LPS组LncRNA HAGLR表达水平升高，miR-625-5p表达水平降低（均为P<0.05）。
2.2　干扰LncRNA HAGLR表达对LPS诱导的ARPE-19细胞损伤的影响
Con组、LPS组、LPS+sh-NC组、LPS+sh-HAGLR组细胞凋亡率，cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平，IL-6、IL-1β水平差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与Con组比较，LPS组细胞凋亡率，cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平，IL-6、IL-1β水平均升高（均为P<0.05）。与LPS+sh-NC组比较，LPS+sh-HAGLR组细胞凋亡率，cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平，IL-6、IL-1β水平均降低（均为P<0.05）(表1)。
2.3　LncRNA HAGLR靶向调控miR-625-5p的表达
LncRNA HAGLR基因序列上存在miR-625-5p结合位点（图1）。miR-NC、miR-625-5p mimics与WT-HAGLR共转染后荧光素酶活性分别为1.08±0.07、0.34±0.04，miR-NC、miR-625-5p mimics与MUT-HAGLR共转染后荧光素酶活性分别为1.06±0.09、1.04±0.08。与miR-NC、WT-HAGLR共转染相比，miR-625-5p mimics、WT-HAGLR共转染后荧光素酶活性明显降低（P<0.05）。与miR-NC、MUT-HAGLR共转染相比，miR-625-5p mimics与MUT-HAGLR共转染后荧光素酶活性差异无统计学意义（P>0.05）。LncRNA HAGLR可负向调控miR-625-5p表达（P<0.05）(表2)。






2.4　miR-625-5p过表达对LPS诱导的ARPE-19细胞损伤的影响
与LPS+miR-NC组比较，LPS+miR-625-5p组miR-625-5p表达水平升高，细胞凋亡率及cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平，IL-6、IL-1β水平均降低（均为P<0.05）（表3）。






2.5　下调miR-625-5p表达可逆转干扰LncRNA HAGLR表达对LPS诱导的ARPE-19细胞损伤的影响
与LPS+sh-HAGLR+anti-miR-NC组比较，LPS+sh-HAGLR+anti-miR-625-5p组miR-625-5p表达水平降低，细胞凋亡率及cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平，IL-6、IL-1β水平均升高（均为P<0.05）(表4)。


3　讨论
视网膜病变机制可能与炎症、氧化应激等有关，ARPE细胞炎症损伤可降低其吞噬功能，促使未消化碎片处于胞浆内，并沉积于基底膜、Bruch膜后形成玻璃膜疣，促使新生血管形成，进而发展为视网膜病变，LPS可作为视网膜病变炎症细胞模型的刺激物^［7］。因而本研究选用LPS构建ARPE-19细胞损伤模型。既往研究显示，LncRNA在LPS诱导的ARPE细胞损伤中可发挥调控作用，并可参与年龄相关性黄斑变性等视网膜病变发生发展过程^［8］。
目前LncRNA HAGLR在LPS诱导的ARPE-19细胞中表达趋势尚未明确，本研究结果显示，LPS诱导的ARPE-19细胞中LncRNA HAGLR表达水平升高。既往研究表明，LncRNA HAGLR在LPS诱导的神经细胞中表达上调，敲低其表达可抑制LPS诱导的神经细胞炎症、神经元凋亡，并可靶向调节miR-182-5p/ATAT1表达，而ATAT1又可激活NLRP3炎症小体加重神经细胞损伤^［9］。LncRNA HAGLR可靶向调控miR-130a-3p表达促进IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，沉默其表达可抑制炎症因子分泌，减少细胞凋亡，减轻软骨细胞炎症损伤，而miR-130a-3p可直接靶向JAK1参与软骨细胞损伤过程^［10］。LncRNA HAGLR可调节miR-204/CDK5R1表达促进周围神经损伤^［11］。由此推测，LncRNA HAGLR表达水平升高可能引起组织或细胞损伤。同时本研究发现，LPS处理后细胞凋亡率及cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平升高，与既往研究结果类似^［12］。Caspase在细胞凋亡信号转导中发挥调节作用，线粒体膜电位变化可促进细胞色素C释放至细胞质，激活Caspase 9、Caspase 3，导致细胞凋亡^［13］。本研究结果表明，干扰LncRNA HAGLR表达后细胞凋亡率降低，通过对凋亡蛋白研究，证实LncRNA HAGLR具有促凋亡作用，提示LncRNA HAGLR可能作为视网膜病变临床治疗的潜在靶点。炎症反应与视网膜病变发生发展密切相关，而ARPE-19细胞受到外界刺激后可产生多种炎症因子，可激活Caspase途径，促使细胞凋亡^［14］。本研究选取检测LncRNA HAGLR对LPS诱导的ARPE-19细胞外分泌炎症因子IL-6、IL-1β水平变化，用于判别LncRNA HAGLR是否可通过调节炎症因子形成以调节炎症反应，结果发现，LPS诱导的ARPE-19细胞中IL-6、IL-1β水平升高，而干扰LncRNA HAGLR后IL-6、IL-1β水平降低，提示干扰LncRNA HAGLR表达可抑制炎症因子分泌，阻断炎症反应相关ARPE-19细胞凋亡。其作用机制可能与LncRNA HAGLR调节miR-182-5p/ATAT1、miR-130a-3p/JAK1、miR-204/CDK5R1表达有关。
本研究证实LncRNA HAGLR可靶向结合miR-625-5p，并负向调控miR-625-5p表达，这也是本研究创新之处。miR-625-5p在LPS诱导的急性肺损伤模型中呈低表达，上调其表达可抑制NF-κB p65蛋白表达，发挥抗炎作用，以减轻急性肺损伤^［15-16］。本研究结果显示，LPS诱导的ARPE-19细胞中miR-625-5p表达水平降低，提示miR-625-5p水平降低可能促进ARPE-19细胞损伤。由此推测，miR-625-5p水平降低可促进炎症因子释放，加重LPS诱导的ARPE-19细胞损伤。本研究进一步分析发现，miR-625-5p过表达可抑制细胞凋亡、炎症因子分泌，而下调其表达可减弱干扰LncRNA HAGLR表达对ARPE-19细胞的损伤作用，提示LncRNA HAGLR可能通过靶向调控miR-625-5p表达参与LPS诱导的ARPE-19细胞损伤过程。
4　结论
LPS诱导的ARPE-19细胞中LncRNA HAGLR表达上调，miR-625-5p表达下调，干扰LncRNA HAGLR表达可通过靶向调节miR-625-5p表达，降低细胞凋亡率、炎症因子表达水平，进而减轻ARPE-19细胞损伤，但关于miR-625-5p是如何调控下游靶基因表达尚需进一步探究。