《眼科新进展》  2023年6期 434-438   出版日期：2023-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
利妥昔单抗对实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠的抗炎作用及其机制


非感染性葡萄膜炎是一类常见的、严重威胁视力的炎症性眼病，好发于青壮年，可造成沉重的社会经济负担［1］。糖皮质激素、免疫抑制剂或生物制剂是目前治疗非感染性葡萄膜炎的主要方式，但这些药物长期使用时疗效局限并可能产生局部或全身副作用［2-3］。因此，寻求一种毒副作用小，疗效确切且稳定的治疗药物成为当前非感染性葡萄膜炎研究的重点。
利妥昔单抗（RTX）是一种人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体，可特异性地与前体B细胞和成熟B细胞膜表面CD20受体结合，已被批准用于治疗类风湿性关节炎、Wegener肉芽肿和寻常型天疱疮等自身免疫性疾病［4］。在炎症性眼病治疗方面有少数应用RTX的病例报道，包括周边溃疡性角膜炎［5-6］、难治性葡萄膜炎［7］、幼年特发性关节炎相关性葡萄膜炎［8］和视网膜血管炎［9-10］等，但其中的具体作用机制尚不明确。本研究通过构建与非感染性葡萄膜炎致病机制相似的实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）小鼠模型［11］，探讨RTX对EAU小鼠的抗炎作用及其机制。
1　材料与方法　
1.1　材料　
1.1.1　实验动物　选取SPF级6～8周龄健康雌性C57BL/6J小鼠27只，体重18～20 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养条件：温度20～26 ℃，相对湿度30%～70%，最低工作照度150 lx，昼夜明暗交替时间12 h/12 h，自由饮水，使用灭菌垫料与鼠粮进行喂养。实验动物操作符合天津医科大学总医院医学动物保护与伦理委员会相关规定。本研究方案经天津医科大学总医院伦理委员会审批（批文号：IRB2022-DW-31）。
1.1.2　试剂及仪器　光感受器间维生素A类结合蛋白1-20（IRBP1-20）多肽、特异性引物（上海生工生物工程股份有限公司），完全弗氏佐剂（美国Sigma公司），结核分枝杆菌（美国Difco公司），百日咳毒素（美国List Biological Laboratories公司），RTX注射液、SYBR（瑞士Roche公司），Trizol（美国Thermo公司），cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技术有限公司），FAS眼球固定液、苏木素、伊红染液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；小动物视网膜成像仪（美国Phoenix Research Labs公司），PCR热循环仪、实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司）。
1.2　方法　
1.2.1　EAU模型的建立及分组　将含有300 μg IRBP1-20多肽的PBS溶液与等体积含有300 μg结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂溶液充分混合为油包水状态的乳化剂，在每只小鼠四肢根部皮下注射50 μL，同时腹腔注射0.5 μg百日咳毒素以增强免疫，建立EAU小鼠模型。采用随机数字表法将EAU小鼠随机分为PBS对照组、50 mg·kg-1 RTX实验组和100 mg·kg-1 RTX实验组，每组各9只小鼠，PBS对照组小鼠腹腔注射PBS,50 mg·kg-1 RTX实验组和100 mg·kg-1 RTX实验组小鼠每千克体重分别腹腔注射50 mg RTX和100 mg RTX，从造模后第1天至第21天对各组小鼠进行连续干预。
1.2.2　EAU小鼠眼底图像采集及临床评分　于造模后第21天，使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，贝复舒凝胶涂眼，通过小动物视网膜成像仪采集各组小鼠眼底图像并参照Caspi临床评分标准进行炎症评分［12］。
1.2.3　EAU小鼠视网膜组织HE染色及组织病理学评分　于造模后第21天，颈椎脱臼法处死小鼠，取一侧眼球置于FAS眼球固定液固定24 h，之后进行梯度酒精脱水，石蜡包埋，再沿瞳孔-视神经轴连续切片，切片厚度为4 μm。然后，将石蜡切片依次进行二甲苯脱蜡，酒精脱水，流水冲洗，HE染色，再经脱水、透明，最后中性树胶封片，完成视网膜组织的HE染色。将HE染色切片置于显微镜下观察并进行拍照，参照Caspi组织病理学评分标准进行评分［12］。
1.2.4　实时荧光定量PCR　采用实时荧光定量PCR检测各组小鼠视网膜组织白细胞介素（IL）-1β、IL-4、IL-6和IL-10 mRNA相对表达量，使用Trizol试剂提取视网膜组织总RNA，NanoDrop one超微量分光光度计测量RNA浓度，根据逆转录试剂盒反应体系将RNA逆转录为cDNA，最后以cDNA和基因特异性引物（表1）为模板，进行实时荧光定量PCR。反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火+延伸1 min，共设置40个循环。反应结束后，应用2-ΔΔCt法计算各基因表达水平。



1.3　统计学方法　采用SPSS 21.0软件进行统计学分析， GraphPad Prism 9软件制作统计图。计量资料以均数±标准差表示。行正态性检验，符合正态分布的数据两组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的数据两组间比较采用非参数检验即Mann-Whitney U检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　各组小鼠眼底图像及临床评分比较　眼底图像显示：PBS对照组EAU小鼠眼底出现多发性血管炎，血管扩张，视网膜脉络膜出现多发病灶及少量线样病变；50 mg·kg-1 RTX实验组EAU小鼠眼底发生轻度血管炎，视网膜出现个别局部病灶，无线样病变；100 mg·kg-1RTX实验组EAU小鼠视网膜局部出现个别病灶，无线样病变（图1）。PBS对照组、50 mg·kg-1 RTX实验组和100 mg·kg-1RTX实验组EAU小鼠眼底图像Caspi临床评分分别为（1.944±0.808）分、（1.667±0.791）分、（1.667±0.829）分，三组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。



2.2　各组小鼠视网膜组织HE染色结果及组织病理学评分比较　HE染色结果显示：PBS对照组EAU小鼠玻璃体内及视网膜组织中出现大量炎症细胞浸润，视网膜结构部分紊乱，存在大量视网膜皱褶，部分光感受器细胞破坏；50 mg·kg-1 RTX实验组EAU小鼠玻璃体内及视网膜组织中有少量炎症细胞浸润；100 mg·kg-1 RTX实验组EAU小鼠视网膜组织中出现少数炎症细胞浸润（图2）。PBS对照组、50 mg·kg-1 RTX实验组和100 mg·kg-1RTX实验组EAU小鼠视网膜组织病理学评分分别为（1.563±1.116）分、（1.063±0.623）分、（1.250±0.655）分，三组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。



2.3　各组小鼠视网膜组织炎症细胞因子表达情况　 实时荧光定量PCR检测结果显示，50 mg·kg-1 RTX实验组和100 mg·kg-1 RTX实验组小鼠视网膜组织IL-6、IL-10 mRNA相对表达量以及IL-10/IL-6比值均高于PBS对照组（均为P<0.05）；100 mg·kg-1 RTX实验组小鼠视网膜组织IL-6、IL-10 mRNA相对表达量以及IL-10/IL-6比值均高于50 mg·kg-1 RTX实验组（均为P<0.05）（表2）。





3　讨论
葡萄膜炎是一类严重威胁视力的眼病，目前仍有部分难治型非感染性葡萄膜炎患者没有合适的治疗方法。少数临床病例报道RTX对葡萄膜炎［13］有一定疗效，但缺乏相关基础实验研究的证据。本研究通过构建EAU小鼠模型探讨不同剂量的RTX在缓解EAU炎症中的作用及机制。研究结果显示，腹腔注射RTX后，不同剂量RTX实验组EAU小鼠视网膜组织IL-6、IL-10 mRNA表达及IL-10/IL-6比值均显著升高（均为P<0.05），且100 mg·kg-1RTX实验组IL-6、IL-10 mRNA表达及IL-10/IL-6比值均高于50 mg·kg-1 RTX实验组（均为P<0.05）。但不同剂量RTX实验组EAU小鼠眼底临床评分与组织病理学评分差异均无统计学意义，结合视网膜组织IL-6与IL-10细胞因子水平的变化与RTX剂量相关，我们考虑给药剂量与取材时间是影响EAU眼底临床表现的主要因素。研究结果显示，腹腔注射RTX可调节EAU小鼠视网膜组织IL-10与IL-6之间的平衡，使IL-10/IL-6比值显著升高且与剂量相关，表明RTX在改善EAU小鼠视网膜组织的炎症性病变中起正向调节作用。
IL-6由内皮细胞和眼实质细胞产生，可促进巨噬细胞激活和B细胞向浆细胞分化，在包括葡萄膜炎在内的多种自身免疫性疾病中发挥重要作用［14］。实验结果显示，腹腔注射RTX后EAU小鼠视网膜组织IL-6 mRNA表达升高，我们考虑这可能与给药方式、给药剂量以及取材时间相关。IL-10是一种重要的抗炎多功能细胞因子，可由多种免疫细胞分泌，可促进B淋巴细胞增殖及抗体分泌，促进非单核细胞依赖性T淋巴细胞增殖成熟［15］。已有文献证明，IL-10的产生与疾病的消退有关，提示其在EAU病情的缓解中可能具有重要意义［16］。Sun等［17］研究发现，在重症肌无力患者中，对RTX治疗反应良好的患者体内B细胞增殖明显，这些B细胞能快速地产生IL-10。Chocova等［18］发现，在抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎中，应用RTX治疗的患者在缓解期产生IL-10的单核细胞比例会保持稳定。在本研究中，不同剂量RTX实验组EAU小鼠视网膜组织IL-10 mRNA表达均显著高于PBS对照组，且100 mg·kg-1RTX实验组IL-10 mRNA表达显著高于50 mg·kg-1 RTX实验组，表明RTX在EAU小鼠的炎症缓解中发挥正向作用。
IL-6和IL-10的表达水平常被用于衡量炎症和抗炎的平衡情况。研究表明，在HLA- B27阳性葡萄膜炎患者以及系统性红斑狼疮患者中,IL-6/IL-10比值与疾病活动程度呈正相关且对患者的预后具有临床指导意义［14,19］。Talaat等［20］研究发现，与健康对照组相比，白塞病患者血清中IL-6/IL-10比值显著升高。本研究结果显示不同剂量RTX实验组EAU小鼠视网膜组织IL-10/IL-6比值均显著升高，提示RTX可通过调节IL-10/IL-6比值改善EAU小鼠视网膜组织的炎性环境且作用强度与RTX剂量相关。
综上所述，我们探讨了不同剂量的RTX对EAU小鼠的抗炎作用及其机制，结果表明，腹腔注射RTX可一定程度缓解EAU小鼠视网膜组织的炎性病变，其机制可能与RTX提高小鼠视网膜组织IL-10/IL-6比值有关。