《眼科新进展》 2023年4期
260-265
出版日期：2023-04-05
ISSN:1003-5141
CN:41-1105/R
针刺对形觉剥夺性近视豚鼠巩膜形态及组织中HIF-1α、SOD、MDA水平的影响
近视是最常见的屈光不正，其中高度近视易引发黄斑病变、视网膜脱离、视网膜下新生血管、脉络膜萎缩及其他并发症，导致不可逆性的视觉损害［1］。流行病学预测结果显示，到2050年，世界近视人口总数将达47.58亿［2］，近视已经成为世界范围内一个严峻的社会、经济及公共卫生问题。因此，建立有效、安全的干预措施对预防近视和控制近视的发生发展是十分必要的。
巩膜是维持眼部形状和完整性的结构框架。目前多数学者认为近视的发展与巩膜重塑有关［3］。Wu等［4］研究认为，巩膜缺氧为近视发生发展中巩膜重塑至关重要的调节因素，且多伴有缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达升高［5-7］。此外，氧化应激也是促进近视形成的重要因素［8-11］。眼部组织光氧化损伤［12］、血管缺血/再灌注［13］等可触发产生活性氧自由基在视网膜、脉络膜中大量聚集，诱导脂质过氧化反应，是导致近视产生的重要原因。针刺疗法是中国传统医学的重要组成部分，在治疗眼部疾病方面有着悠久的历史，当代学者通过研究也已证实针刺能调节眼局部气血阴阳，疏通经络，调整眼部病理状态，改善近视的发生发展［14-16］。本研究的目的是探索针刺是否通过调节形觉剥夺性近视（FDM）豚鼠巩膜组织中HIF-1α、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛（MDA）的表达来延缓近视的发生发展，以丰富近视形成的机制，并为针刺治疗近视提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物与分组 普通级3周龄健康三色豚鼠72只，体重160~200 g，雌雄各半，购于成都恩斯维尔生物科技有限公司（生产许可证号：SCXK陕2017-002）。将豚鼠饲养于成都中医药大学动物实验室，全部动物都饲养在温度（24±2）℃、空气相对湿度约为50%的条件下，光照按正常昼夜节律设定为12 h光照（光照强度为500 lux）/12 h黑暗，实验过程中豚鼠除自由获取饲料与饮水以外，还每日定时给予新鲜蔬菜以确保豚鼠维生素C摄入充足。豚鼠适应性饲养3~7 d后，随机分为空白组、模型组和针刺组（各24只）；实验前排除患有角膜炎、结膜炎等眼部疾病者。整个实验过程对豚鼠的处置均严格遵循《关于实验教学中实验动物的伦理学研究》［17］一文提出的原则，并经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准（实验动物福利伦理审核申请备案编号：2021-39）。
1.1.2 主要试剂与仪器 HIF-1α抗体（novusbio）、β-actin抗体（abclonal）、羊抗兔IgG（H+L）（affinity）、SOD检测试剂盒、MDA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；华佗牌针灸针及SDZ-Ⅱ型脉冲电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；带状光检影镜及镜片箱（苏州六六视觉科技股份有限公司）；SW-1000眼科A型超声诊断仪（天津市索维电子技术有限公司）；Spectra MAX Plus384酶标仪（美谷分子仪器有限公司生产）；Pannoramic 250数字切片扫描仪（3DHISTECH，匈牙利）；V2.0 GIS机箱控制软件（天能集团）。
1.2 方法
1.2.1 动物模型建立 采用形觉剥夺法建立FDM模型［18］。模型组及针刺组豚鼠右眼均以半透明气球作为眼罩固定于头面部，左眼作为自身对照眼予充分暴露，造模时间分别为2周和4周；造模后以豚鼠近视屈光度增加、眼轴增长，即达到“相对近视”判定为近视造模成功。造模期间豚鼠正常摄食、进水，每天3次检查眼罩有无脱落，一旦发现脱落，立即重新固定；空白组豚鼠不做任何处理。
1.2.2 针刺组干预方式 针刺组豚鼠造模当天即接受针刺及电针干预治疗，参照1992年版豚鼠针灸穴位图谱［19］定位及针刺方法，针刺取“太阳”“合谷”“肝俞”“神庭”“百会”“大椎”，采用0.25 mm×13.00 mm一次性针灸针，“太阳”向后斜刺2 mm，“合谷”直刺3 mm，“肝俞”直刺8 mm，“神庭”向上横刺2 mm，“百会”向前斜刺2 mm，“大椎”直刺15 mm，平补平泻，得气后“百会”“大椎”加电针干预，频率为2 Hz，强度为2 mA，每天1次，每次30 min，持续4周；整个过程均由同一针灸师操作完成。模型组及空白组豚鼠不予针刺干预。
1.2.3 各组豚鼠眼生物学测量 造模前及造模后2周、4周各组豚鼠均行生物学测量。测量前所有豚鼠均行散瞳验光，每次测量前均使用5 g·L-1复方托吡卡胺滴眼液每隔5 min滴眼1次，共4次；瞳孔充分散大后用带状光检影镜于暗室检影验光检测屈光度，每眼连续测定3次，取其平均值。屈光度使用等效球镜记录，即为球镜度数+1/2柱镜度数。采用A型超声诊断仪测量眼轴长度，先用4 g·L-1盐酸奥布卡因滴眼液滴眼2次行表面麻醉，将A型超声探头在角膜表面呈垂直角度对准瞳孔中心，获得理想波形，记录眼轴长度，连续测5次，去掉明显偏差值并取其平均值，全过程由同一技师进行操作。
1.2.4 取材方式 造模后4周，腹腔注射过量100 g·L-1水合氯醛处死所有豚鼠，摘除右眼眼球并放置于冰块上保存，快速环状剪开角膜缘，去除眼前节、玻璃体及其他组织，剥离出巩膜用于后续实验。
1.2.5 HE染色观察各组豚鼠巩膜组织病理学变化 每组随机选取6只豚鼠右眼巩膜组织将其固定于体积分数10%中性甲醛溶液中，经全自动脱水机脱水后进行修剪，石蜡包埋后行组织切片（厚度为3 μm），脱蜡至水，放入苏木精染色液中15 min，自来水冲洗，盐酸酒精分化处理10 s，然后清洗，再放入50 ℃的温水中返蓝，再洗，放入体积分数85%的酒精5 min，伊红染色液染色5 min，梯度酒精脱水，封片后进行镜检。先于光学显微镜100倍下观察每张切片局部组织，然后于400倍下观察巩膜组织着色情况及巩膜组织结构病理特点。
1.2.6 Western blot检测各组豚鼠巩膜中HIF-1α蛋白相对表达量 每组随机选取6只豚鼠右眼巩膜组织，提取巩膜中的蛋白质，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，各组取50 μL蛋白，按4∶1的比例加入5×Loding buffer，混匀后置热循环仪中95 ℃ 15 min，-80 ℃保存。上样、电泳、转膜，体积分数5%脱脂牛奶封闭2 h，4 ℃孵育过夜。一抗（HIF-1α稀释度为1∶1000，β-actin稀释度为1∶100 000）4 ℃孵育过夜，洗膜，二抗（稀释浓度为1∶5000）室温孵育2~3 h，洗膜。采用化学发光试剂进行曝光、显影。定影后行凝胶图像分析，采用天能GIS机箱控制软件V2.0曝光扫描条带，结果用目的蛋白相对表达量（目的蛋白相对表达量=目的蛋白积分光密度/内参积分光密度）表示。
1.2.7 各组豚鼠巩膜中SOD活力及MDA含量的检测 取每组剩余豚鼠右眼巩膜组织，采用比色法检测氧化因子SOD活力和MDA含量。根据SOD检测试剂盒说明书，在96孔板上设置测定孔和空白对照孔，再将样本和试剂充分混合，搅拌均匀后于37 ℃ 下孵育20 min，在波长450 nm处酶标仪读数，SOD活力按试剂盒说明书公式计算。根据MDA检测试剂盒说明书设置测定管和空白管，加入试剂后，涡旋混匀器混匀，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷却，4000 r·min-1离心10 min后取上清，在波长532 nm 处使用酶标仪测定吸光度，MDA含量参照试剂盒说明书公式计算。
1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x?±s）表示，多样本均数之间的比较用One-Way ANOVA检验，方差齐用LSD检验，方差不齐则用Tamhane’s T2检验。检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 各组豚鼠屈光度变化 造模前，空白组、模型组和针刺组豚鼠双眼屈光状态均为远视，各组豚鼠双眼间屈光度比较差异均无统计学意义（均为P>0.05）；各组豚鼠间相比，左眼、右眼屈光度差异均无统计学意义（均为P>0.05)。造模后2周和4周，随造模时间延长，空白组豚鼠双眼和模型组、针刺组豚鼠的自身对照眼（左眼）远视度数均逐渐降低，为豚鼠逐渐正视化过程，但相同时间点各组之间差异均无统计学意义（均为P>0.05）。造模后2周和4周，与空白组比较，模型组及针刺组豚鼠遮盖眼（右眼）近视屈光度均明显增加(均为P<0.05)；与模型组比较，针刺组豚鼠遮盖眼近视屈光度均减小（均为P<0.05）（表1）。
2.2 各组豚鼠眼轴长度变化 造模前，空白组、模型组和针刺组豚鼠双眼间眼轴长度比较差异无统计学意义（P>0.05）；各组豚鼠间相比，左眼、右眼眼轴长度差异均无统计学意义（均为P>0.05)。造模后2周和4周，随造模时间延长，空白组豚鼠双眼和模型组、针刺组豚鼠的自身对照眼眼轴长度均略有延长，但相同时间点各组之间差异均无统计学意义（均为P>0.05）。造模后2周和4周，与空白组比较，模型组及针刺组豚鼠遮盖眼（右眼）眼轴长度均明显延长(均为P<0.05)；与模型组比较，针刺组豚鼠遮盖眼眼轴长度均较短（均为P<0.05）（表2）。
2.3 各组豚鼠巩膜形态变化 造模后4周光学显微镜下观察：空白组豚鼠的巩膜组织染色可见成纤维细胞核为蓝紫色，梭形或长圆形，细胞外基质为粉红色；巩膜的厚度和形态正常，巩膜内胶原纤维排列规则，走行正常，直径均匀，内含少量血管、神经、纤维细胞和色素细胞，未见明显病理变化。与空白组比较，模型组豚鼠巩膜厚度明显变薄，胶原纤维分布稀疏，有明显纤维空隙且排列不规则。与模型组比较，针刺组豚鼠巩膜层增厚，与胶原纤维分离程度较小，且排列更加规则（图1）。
2.4 各组豚鼠巩膜中HIF-1α蛋白表达 Western blot检测结果显示，造模后4周，与空白组比较，模型组豚鼠巩膜中HIF-1α蛋白表达水平显著增高（P<0.01）；与模型组比较，针刺组豚鼠巩膜中HIF-1α蛋白表达水平明显降低（P<0.01）（图2）。
2.5 各组豚鼠巩膜中SOD活力和MDA含量 造模后4周，与空白组相比，模型组豚鼠巩膜中SOD活性明显降低，MDA含量显著升高（均为P<0.01）；与模型组相比，针刺组豚鼠巩膜中SOD活性明显增强，MDA含量明显降低（均为P<0.05）（表3）。
3 讨论
在当前的近视实验研究中，研究人员以动物为基础构建了多种近视模型来探讨近视的发病机制，其中豚鼠屈光状态、正视化机制类似于人类，因此是近年来国内外使用最广泛的近视研究动物模型之一［20-21］。目前，根据造模方式不同实验性近视动物模型主要有两种，即FDM模型（缝合眼睑或用半透明眼罩遮盖造模）和光学离焦性近视(LIM)模型（给动物配戴负球镜片）［18］。研究表明，豚鼠对形觉剥夺高度敏感，是较为理想的实验性近视动物模型［22］，因此本实验选取豚鼠为实验对象，采用半透明眼罩遮盖豚鼠右眼的造模方式。本实验结果显示，形觉剥夺可以使豚鼠被剥夺眼较自身对照眼近视度数及眼轴长度均明显增加，屈光状态迅速从远视向近视转变，与以往研究结果一致［23］。本研究针刺干预后，豚鼠被剥夺眼近视度数减小且眼轴增长减缓，表明针刺可以通过延缓FDM豚鼠近视屈光度和眼轴长度的增长来延缓近视形成与发展。
HIF-1α是一种重要的转录因子，在低氧反应中调节基因表达［24］；SOD是活性氧清除酶系统的重要保护酶，在维护细胞活性氧代谢的平衡中起重要作用；MDA作为机体脂质过氧化的最终产物，反映了细胞受自由基攻击的严重程度；在生理状态下，三者作为维持氧稳态的主要调节因子对巩膜及其他生理组织具有保护作用。病理状态下，HIF-1α表达水平升高，是造成巩膜缺氧而致近视的重要因素［4，25］，脉络膜血流量是巩膜氧气和营养供应的主要来源，改善脉络膜血液灌注［26］、玻璃体注射抗缺氧药物(红景天苷或芒柄花素)［4］及电针干预［27］可通过下调HIF-1α表达进而改善巩膜缺氧延缓近视的发展。在关于近视氧化应激的研究中，Liu等［28］实验研究发现，兔在氧化应激状态时，抗氧化能力降低，影响线粒体中氧化磷酸化作用的发挥，释放大量氧自由基，促使巩膜细胞发生凋亡，诱导近视性巩膜生长；高度近视的豚鼠巩膜组织中，也发现SOD活力降低及MDA含量增加［29］；同时大量研究表明，多数抗氧化相关的微量元素不足也与近视的发展之间存在关联，如锌（Zn）、硒（Se）、α-生育酚（维生素E）、抗坏血酸（维生素C）等元素在抗氧化过程和巩膜的生化重建中起重要作用［30-33］。这表明巩膜缺氧及氧化应激损伤参与了近视的形成与发展，而改善巩膜缺氧及抗氧化应激能有效缓解这一现象。本研究结果显示，随着近视的进展，模型组豚鼠巩膜中HIF-1α蛋白表达增加、MDA含量增高、SOD活性降低，进一步证实了巩膜缺氧及氧化应激机制参与了近视的形成；而针刺可通过抑制HIF-1α蛋白表达，增强巩膜组织中SOD活性，降低MDA表达，延缓近视的发生发展。
近视，中医称之为“目不能远视”“能近怯远症”“近觑”等，最早见于《诸病源候论》，皇甫谧《针灸甲乙经》中“远视不明，承光主之”是针刺治疗近视最早的记载。在近视病因病机方面，《银海精微》中阐述了“血虚气不足”而致近视的观点；《审视瑶函》《景岳全书》及《目经大成》等皆提出近视的形成与“阳气不足”有关。因此，结合病因病机，在针刺治疗的选穴上应当以生发阳气、调补气血为主，同时参考针刺治疗近视的循经与取穴规律“多选阳经，多选眼周穴位”的特点［34］，本研究取神庭、百会、大椎、太阳、合谷和肝俞穴，以探讨针刺对豚鼠近视的调控作用。其中督脉穴（神庭、百会、大椎）鼓动阳气，使阳气升发于目，神光有所发越；太阳穴能疏通眼部经气，缓解睫状肌疲劳和痉挛，促进眼动脉血液循环；阳明经多气多血，合谷是阳明经之原穴，又位关口，是调理人体气机之大穴，通过调气，可达理血活血之功效；肝俞为肝之背俞穴，刺激后能增强肝脏藏血和调节血量的功能，使气血上注于目，血量丰富而增加眼中含氧量从而目有所养。肝俞穴配伍产生协同增效作用，使经络疏通，气血阴阳调和，目系得以濡养而光华发越，神光及远。
本研究结果表明，在形觉剥夺后，FDM模型组豚鼠近视屈光度增加、眼轴增长、巩膜形态发生病理性改变，逐渐形成近视，这一变化可能与巩膜组织中HIF-1α大量积聚及SOD活性降低，MDA含量升高密切相关。而针刺可通过抑制HIF-1α表达而改善巩膜缺氧；同时针刺可增强巩膜组织中SOD活性，减少MDA蓄积，提高氧自由基的清除能力以改善巩膜氧化应激状态。因此，针刺作为一个便捷、安全、接受程度高的治疗方式，有可能成为防控近视的有效手段，但其作用的具体机制尚未完全明确，仍需进一步探索和研究。