《眼科新进展》 2022年11期
853-857
出版日期：2022-11-05
ISSN:1003-5141
CN:41-1105/R
青蒿琥酯对大鼠实验性视网膜分支静脉阻塞的抑制作用
视网膜静脉阻塞（RVO）是继糖尿病视网膜病变后第二位常见视网膜血管病变，由于组织缺血、缺氧常引起黄斑水肿及视网膜新生血管病变，RVO是当前主要的致盲性眼病之一［1］。RVO发病机制尚不清楚，血管内皮生长因子（VEGF）在其中起着重要作用，玻璃体内注射抗VEGF药物是目前西医治疗RVO继发黄斑水肿的主要手段［2］。然而，抗VEGF药物治疗后黄斑水肿易反复发作，且价格昂贵，频繁注射不仅增加患者发生眼内炎、视网膜萎缩等的风险，更加重患者的经济负担。因此，寻找一种安全有效、价格低廉，更适用于临床治疗RVO的药物显得至关重要。
青蒿琥酯（Art）是青蒿素的衍生物之一，除抗疟作用外，还同时具有抗病毒、抗炎、免疫调节及抑制血管增生等作用［3］。前期有关研究报道，Art能够通过下调VEGF表达抑制兔虹膜和视网膜新生血管形成［4］。且研究发现，Art通过调控HIF-1α/VEGF信号通路抑制肿瘤血管新生［5］。然而，目前有关Art在RVO治疗方面的研究鲜有报道。我们前期针对RVO致病原因、RVO继发黄斑水肿发病机制、Art潜在作用靶点及Art治疗RVO继发黄斑水肿的效果进行了探讨［6］。本研究通过532 nm激光建立大鼠视网膜分支静脉阻塞（BRVO）模型，观察Art对BRVO的干预作用，以及对HIF-1α/VEGF信号通路的影响，进一步探讨Art治疗RVO的分子机制，以期为临床治疗RVO提供新思路和新方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物及分组 取SPF级雌性Wistar大鼠（6~8周龄）150只，体重（200±20）g，眼前节、眼底检查无异常，大鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司。饲养条件：温度（22±1）℃，湿度60%~70%，光照12 h明暗交替。适应性饲养1周后，将动物随机分为6组，每组25只，右眼为实验眼：空白对照组、模型对照组（玻璃体内注射生理盐水）、康柏西普组（玻璃体内注射康柏西普）、Art高浓度组（玻璃体内注射50.0 mg·L-1 Art）、Art中浓度组（玻璃体内注射25.0 mg·L-1 Art）、Art低浓度组（玻璃体内注射12.5 mg·L-1 Art）；空白对照组采用未造模大鼠进行实验，其他各组采用BRVO模型大鼠进行实验。本研究动物处理遵循《实验动物管理条例》（2017修订版）的规定。
1.1.2 主要试剂与仪器 注射用Art（规格：60 mg；国药准字：H10930195）（桂林南药股份有限公司），康柏西普眼用注射液（规格：10 g·L-1，0.2 mL/支；批号：202006b07）（成都康弘生物科技有限公司），复方托吡卡胺滴眼液、氧氟沙星滴眼液及加替沙星眼用凝胶（沈阳兴齐眼药股份有限公司），孟加拉红（北京百奥莱博科技有限公司），SYBR Green荧光定量试剂盒（TaKaRa公司），实验研究引物（大连万泽贸易有限公司）。Nd:YAG激光光凝仪（法国Quantel Medical公司），Speotralis HRA+OCT激光眼科诊断仪（德国Heidelberg公司），CFX-96实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠BRVO模型建立 参照邹红等［7］采用光化学法建立大鼠BRVO模型：以复方托吡卡胺滴眼液滴大鼠右眼充分散瞳，称重后按照10 g·L-1水合氯醛溶液（3.5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，以30 mg·kg-1尾静脉注射孟加拉红溶液（30 g·L-1），行角膜表面麻醉及眼表涂加替沙星眼用凝胶后放置盖玻片，以532 nm激光封闭视网膜视盘颞上方相邻2支视网膜静脉（光斑直径50 μm，能量100 mW，曝光时间0.2 s）。每支静脉光凝25~30点，使被光凝封闭的静脉段长度约1视盘直径，被封闭静脉变细变白，血流停滞，远端迂曲扩张。之后行眼底照相及荧光素眼底血管造影检查，验证造模是否成功。
1.2.2 玻璃体内注射治疗 造模成功后第3天给药。大鼠称重后腹腔注射麻醉，右眼以复方托吡卡胺滴眼液滴眼充分散瞳。行角膜表面麻醉后将大鼠置于手术显微镜下，左手持显微镊固定眼球，右手持微量注射器距角膜缘后1 mm处用30G注射针头垂直巩膜进针，进针后立即调整注射角度，避免划伤晶状体或损坏视网膜，缓慢推入3 μL药物或生理盐水，留针30 s后迅速拔出针头，立即用消毒棉签轻压注射点止血，局部涂抹加替沙星眼用凝胶。
1.2.3 视网膜组织病理学观察 玻璃体内注药后1 d、3 d、7 d和14 d，过量麻醉处死大鼠后小心摘取眼球，分离视网膜组织，按染色要求处理后行石蜡包埋，4 μm连续切片。常规脱蜡后行HE染色，于200倍光镜下观察距视盘中心上方15 mm处视网膜组织的病理学改变并照相，采用LEICAQWIN图像分析软件于距视盘中心15 mm处双侧测量视网膜内层（包括内核层、内丛状层、神经节细胞层和神经纤维层）厚度，每只眼球取6张切片，结果取平均值。
1.2.4 实时荧光定量PCR检测视网膜组织VEGF、HIF-1α mRNA表达 玻璃体内注药后1 d、3 d、7 d和14 d，过量麻醉处死大鼠后小心摘取眼球，分离视网膜组织，Trizol法提取总RNA，测定浓度后，将总RNA逆转录为cDNA，并以此为模板进行后续实验。引物序列见表1。使用2-ΔΔCt计算各mRNA的相对表达量。
1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0统计学软件对所得数据进行统计学分析。数据符合正态分布且方差齐，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 玻璃体内注药后各组大鼠眼底照相检查结果 玻璃体内注药后1 d，模型对照组，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠出现视网膜静脉阻塞、迂曲扩张及视网膜出血水肿表现。玻璃体内注药后7 d，康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜静脉再通，仅有小部分静脉血管阻塞；而康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜静脉阻塞表现差异不明显（图1和图2）。
2.2 玻璃体内注药后7 d各组大鼠视网膜组织HE染色结果 玻璃体内注药后7 d，空白对照组大鼠视网膜组织结构完整、层次清晰，细胞排列整齐；模型对照组大鼠视网膜组织水肿，其中神经纤维层与内丛状层水肿明显，视网膜神经节细胞可见空泡样变性。康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜水肿基本消失，视网膜神经节细胞空泡变性明显改善（图3）。
2.3 玻璃体内注药后不同时间各组大鼠视网膜内层厚度比较 玻璃体内注药后不同时间各组大鼠视网膜内层厚度见表2。玻璃体内注药后3 d、7 d、14 d，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠视网膜内层厚度明显小于模型对照组（均为P<0.05），康柏西普组与Art高、中、低浓度组间差异无统计学意义（均为P>0.05）。
2.4 玻璃体内注药后不同时间各组大鼠视网膜组织VEGF、HIF-1α mRNA相对表达量 玻璃体内注药后1 d、3 d，模型对照组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量较空白对照组均升高（均为P<0.05）；注药后7 d， HIF-1α mRNA相对表达量则降低（P<0.05）。注药后1 d、3 d，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量较模型对照组均降低（均为P<0.05）。注药后7 d，Art中、低浓度组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量较模型对照组则均升高（均为P<0.05）（表3）。
玻璃体内注药后7 d、14 d，模型对照组大鼠视网膜组织VEGF mRNA相对表达量较空白对照组均升高（均为P<0.05）；康柏西普组，Art高、中、低浓度组VEGF mRNA相对表达量较模型对照组均降低（均为P<0.05）（表4）。
3 讨论
视网膜血管阻塞病理机制复杂，其发病与高血压、糖尿病、动脉硬化等全身性疾病关系密切。尽管玻璃体内注射抗VEGF药物是目前治疗RVO继发黄斑水肿的有效方法，但抗VEGF治疗仍存在诸多局限性，患者易反复发作黄斑水肿，且抗VEGF药物价格昂贵，频繁注射不仅增加患者发生眼内炎、视网膜萎缩等风险，更加重患者的经济负担。
Art是青蒿素的衍生物之一，由于其半衰期长、水溶性好、副作用少等特点，近年来被广泛用于眼科临床。根据Art的药理特点，我们推测它能对RVO产生一定的治疗效果。Li等［8］利用玻璃体内注射80 μg Art治疗因角膜、虹膜和视网膜新生血管所致的无光感患者，发现注射 Art后患者眼部新生血管均较以前减少，视盘水肿减轻。我们前期亦总结了Art在眼科的应用前景及潜在作用机制，并针对RVO致病原因、RVO继发黄斑水肿发病机制、Art潜在作用靶点以及Art对RVO继发黄斑水肿的治疗作用进行了探讨［9］。
本次我们通过眼底照相观察发现，玻璃体内注药后1 d，模型对照组，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠均出现视网膜静脉阻塞、迂曲扩张及视网膜出血水肿表现。玻璃体内注药后7 d，康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜静脉再通，仅有小部分静脉血管阻塞；而康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜静脉阻塞表现差异不明显。HE染色结果显示：玻璃体内注药后7 d，空白对照组大鼠视网膜组织结构完整、层次清晰，细胞排列整齐；模型对照组大鼠视网膜组织水肿，其中神经纤维层与内丛状层水肿明显，视网膜神经节细胞可见空泡样变性。康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜水肿基本消失，视网膜神经节细胞空泡变性明显改善。玻璃体内注药后3 d、7 d、14 d，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠视网膜内层厚度均明显小于模型对照组。这提示Art对实验性BRVO所致视网膜损伤具有一定保护作用。
本研究中玻璃体内注药后1 d、3 d，模型对照组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量较空白对照组均升高；注药后7 d， HIF-1α mRNA相对表达量则降低。注药后1 d、3 d，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量较模型对照组均降低。由此可见，Art能够通过降低造模后早期HIF-1α的表达以及造模后期VEGF的表达，从而减少大鼠实验性BRVO的视网膜损伤。
目前制作BRVO模型方法较多，如血管结扎法、透热法和光化学法等。由于光化学法只损伤视网膜血管内皮细胞，通过一系列级联反应导致血小板聚集形成血栓，与人类BRVO的静脉血栓成分及形成机制相近似，操作简便且对动物眼球损伤小［10］，因此，本研究采用此种造模方法。
综上所述，体内研究结果证实Art能够减轻BRVO大鼠视网膜损伤程度，其机制可能与调控HIF-1α/VEGF信号通路有关。Art作为中医药作用靶点多且毒副作用小，其在眼科疾病中有广阔的应用前景，它的潜在价值有待进一步研究证实。