《眼科新进展》 2022年3期
210-213
出版日期：2022-03-05
ISSN:1003-5141
CN:41-1105/R
短期高浓度葡萄糖摄入对小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎发展的作用
葡萄膜炎是一类可累及葡萄膜和视网膜的眼内炎症疾病，是世界范围内常见的致盲性眼病［1］。其中超过半数的葡萄膜炎属于自身免疫性葡萄膜炎，与自身免疫调节机制紊乱或自身抗原免疫应答过强相关。实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）是用完全弗氏佐剂（CFA）和眼内活性抗原诱导的动物模型，包括光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)、视网膜S抗原、视紫红质和视蛋白等，已经广泛应用于自身免疫性葡萄膜炎的研究。最近研究表明，辅助性T细胞17 (Th17)是EAU和多种自身免疫性疾病的重要致病亚群，其分泌的白细胞介素17 （IL-17）是EAU的标志性炎症因子［2］。
近年来，随着经济条件的改善和生活节奏的加快，人们的饮食模式也逐渐偏向高盐、高糖、高脂的西式饮食形式。这种饮食模式不仅导致了肥胖、高血压和糖尿病的发病率升高，还是自身免疫性疾病的潜在危险因素［3］。例如，高盐饮食被证实可以引起小鼠巨噬细胞的过度激活和浸润，从而进一步引起自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的加重［4］。最近也有研究证实，高浓度葡萄糖摄入可以促进Th17细胞的过度激活，从而加重EAE和T细胞转移性结肠炎的严重程度［5］。 但西式饮食在EAU中的作用尚未见相关研究报道，本研究旨在探索短期高浓度葡萄糖摄入对小鼠EAU的作用，以期为非感染性葡萄炎患者的生活管理方案提供一定的启示。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康SPF级6~8周龄雌性B10.RIII小鼠38只，体重为（18.0±1.5）g，购自Jackson实验室，饲养于武汉大学人民医院动物实验中心SPF环境中，室温（24±2）℃，相对湿度50%，12 h/12 h明暗光照下饲养。
1.1.2 主要试剂及仪器 葡萄糖（国药集团，上海），IRBP 161-180（生工生物工程有限公司，上海），CFA（Sigma-Aldrich,美国），荧光定量PCR（QT-PCR）及逆转录试剂均购自南京诺唯赞生物科技公司，小鼠ELISA（IL-17、IFN-γ）试剂盒（华联科生物科技公司，武汉），淋巴细胞分离液（MP Biomedicals,美国），RPMI-1640培养基（赛维尔，武汉），胎牛血清（Gibco公司,澳大利亚），APC-CD4、BV421-CD3、PE-IL-17（BD公司，美国），刺激阻断合剂、流式固定/破膜试剂盒和Fc受体阻断剂均购买自美国BD公司。CFX荧光定量PCR仪（BIO-RAD，美国），酶标仪（Perkin Elmer,美国），CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter,美国)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及处理 采用随机数字表法将小鼠分为模型对照组（EAU组,19只）和高糖模型组（GLU组，19只），GLU组小鼠于造模前14 d开始给予200 g·L-1葡萄糖溶液饮水直至处死，EAU组小鼠给予正常饮水，同时保证两组小鼠每日摄入饲料量相同。参照文献［6］，将IRBP161-180和CFA充分乳化混合后，对EAU组和GLU组小鼠进行双侧大腿和尾部皮下注射，每只小鼠注射IRBP161-180的量为25 μg，是传统造模方式的一半剂量［7］。
1.2.2 两组小鼠临床评分和组织病理学评分 造模后14 d，每组随机取6只小鼠进行双眼裂隙灯检查，按照Caspi分级标准进行EAU的临床评分。于造模后14 d，每组随机抓取6只小鼠处死，摘除双眼眼球，眼球固定液固定24 h,石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，正置显微镜下根据Caspi分级标准进行组织病理学评分［7］。实验重复3次取均值。
1.2.3 QT-PCR检测两组小鼠视网膜中IL-17和IFN-γ的表达 于造模后14 d，每组各取3只小鼠处死，摘除双眼眼球，无酶条件下分离视网膜组织，按照逆转录试剂盒说明书提取RNA，并根据逆转录试剂盒说明书反转录为cDNA,随后进行QT-PCR检测。内参采用β-actin,上游引物为5’-GAAGTCCCTCACCCTCCCAA-3’，大小为20 bp，下游引物为5’-GGCATGGACGCGACCA-3’，大小为16 bp；IL-17上游引物为5’-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC，大小为22 bp,下游引物为5’-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3’,大小为24 bp;IFN-γ上游引物为5’-AGAGGATGGTTTGCATCTGGGTCA-3’，大小为24 bp，下游引物为5’-ACAACGCTATGCAGCTTGTTCGTG-3’，大小为24 bp。反应体系设置为95 ℃、30 s，反应循环一次；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，反应循环40次；95℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，反应循环1次。使用2-ΔΔCt计算IL-17和IFN-γ的相对表达量。实验重复3次取均值。
1.2.4 ELISA检测两组小鼠眼球和血清中IL-17和IFN-γ的蛋白水平 于造模后14 d，每组各取6只小鼠处死，取血清，根据试剂盒说明书进行操作，利用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算样品血清中IL-17和IFN-γ的水平；摘取双眼眼球并粉碎，3500 r·min-1离心5 min，取上清，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算各组小鼠眼球组织上清液中IL-17和IFN-γ的水平。
1.2.5 流式细胞仪检测两组小鼠脾脏中Th17水平 于造模后14 d，每组各取4只小鼠处死取脾脏，用5 mL注射器轻轻研磨。70 μm细胞筛过滤，随后按照淋巴细胞分离液的操作说明分离淋巴细胞，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞并接种于24孔板。每孔加入2 μL刺激阻断合剂，置于37 ℃、含体积分数5%CO2细胞培养箱中孵育6 h。孵育后加入1 μL Fc受体阻断剂避光孵育15 min，洗涤后用BV421-CD3、APC-CD4进行细胞表面染色，避光孵育30 min后洗涤，用固定破膜试剂盒对细胞破膜固定，用PE-IL-17对细胞进行胞内染色，孵育30 min后洗涤，用300 μL PBS重悬，流式细胞仪检测Th17水平，用CytExpert分析结果。实验重复3次取均值。
1.3 统计学处理 采用Graphpad Prism 6统计软件进行数据分析，分析两组小鼠临床评分和组织病理学评分时，采用Mann-Whitney检验；分析计量资料时采用t检验。检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 两组小鼠临床评分和组织病理学评分 于炎症高峰期（造模后14 d）通过裂隙灯观察发现，GLU组小鼠多数出现全眼球炎，伴有出血、角膜新生血管、极重度虹膜睫状体炎等表现，评分为（3.00±0.27）分；EAU组小鼠多为中重度虹膜睫状体炎，评分为（1.58±0.25）分；两组小鼠临床评分差异有统计学意义（P=0.002）（图1）。造模后14 d，两组小鼠视网膜组织病理学切片显示，GLU组小鼠多存在极重度视网膜炎症细胞浸润，病变累及全视网膜并伴全层结构损害，评分为(3.08±0.23)分；EAU组小鼠多存在周围血管渗出和炎症细胞浸润，病变范围≥1/4视网膜且结构损害累及外核层并伴有轻微渗出性视网膜脱离，评分为（1.88±0.30）分；两组间评分差异有统计学意义（P=0.008）（图2）。临床评分和组织病理学评分结果表明，GLU组小鼠炎症显著重于EAU组。
2.2 QT-PCR检测两组小鼠视网膜IL-17和IFN-γ的表达 造模后14 d，GLU组小鼠视网膜组织IL-17相对表达量为2.88±0.44，高于EAU组（1.24±0.36），差异具有统计学意义（ P=0.017）；GLU组小鼠视网膜组织IFN-γ的相对表达量为1.50±0.20，高于EAU组（1.04±0.14），但差异无统计学意义（P=0.081）。
2.3 ELISA法检测两组小鼠眼球组织和血清中IL-17和IFN-γ的蛋白水平 测得IL-17的标准曲线方程为Y=12.386X2+145.76X-9.050 8（R2=0.999 4），IFN-γ的标准曲线方程为Y=48.502X2+227.07X-3.470 7（R2=0.999 1）。根据标准曲线方程计算两组小鼠眼球组织和血清中IL-17和IFN-γ蛋白表达水平，结果显示，GLU组小鼠眼球组织和血清IL-17蛋白水平均高于EAU组，差异均有统计学意义（P=0.030、0.002）；GLU组小鼠眼球组织和血清中IFN-γ蛋白水平均高于EAU组,但差异均无统计学意义（P=0.781、0.589）（表1）。
2.4 两组小鼠脾脏中Th17细胞比例 流式细胞仪检测结果显示，造模后14 d，GLU组小鼠脾脏Th17细胞占CD4+细胞比例为（2.15±0.06）%，显著高于EAU组［（1.81±0.06）%］，差异有统计学意义（P=0.007）（图3）。
3 讨论
眼球作为典型的免疫豁免器官之一，以前一直被认为是与免疫系统相隔绝的，但最近越来越多的研究表明，眼球与肠道的免疫系统是密切相关的。Horai等［8］研究发现，在肠道被微生物组激活的IRBP特异性T细胞可以迁移到眼球内攻击视网膜的抗原，导致EAU的发生；也有研究表明［9-10］，通过在小鼠的饮水中添加广谱抗生素可以通过改变肠道微生物的组成来减轻EAU的严重程度。此外，Du等［11］发现，小檗碱灌胃可以改变肠道微生物的结构和脾脏的基因表达来减轻小鼠EAU的症状，唐凯等［12］则利用大鼠模型发现龙胆泻肝汤通过调节自身免疫反应来减轻EAU的炎症。这些研究结果都表明了“肠-眼”轴的重要意义，揭示了通过干预饮食来调节EAU的潜力。
在本研究中，我们发现短期口服高浓度葡萄糖加重了小鼠在EAU炎症高峰期时（造模后14 d）的炎症，QT-PCR和ELISA检测结果显示这种炎症加重作用主要与IL-17有关，而与IFN-γ无关，血清ELISA和脾脏流式细胞仪的检测结果也显示，高浓度葡萄糖摄入增加了小鼠脾脏中Th17细胞的比例。IL-17是主要由Th17细胞分泌的促炎因子，在多种自身免疫性疾病的发生和发展中发挥了至关重要的作用［13］。与此前EAE和T细胞转移性结肠炎的研究一致［5］，本研究也发现短期高浓度葡萄糖摄入可以增加外周血Th17细胞的比例，使得炎症部位的IL-17表达升高，从而增加了炎症的严重程度。事实上，Th17细胞及其分泌的IL-17不仅在EAU模型中发挥了重要作用，其在临床上多种非感染性葡萄膜炎中的致病作用也已被证实。Chi等［14］发现，白塞病患者外周血T细胞分泌的IL-17较正常人显著升高，并且白塞病患者炎症的活动性也被证实与Th17细胞表达谱密切相关［15］；IL-17的上调也在VKH患者的外周血中发现［16］，并且另有研究表明，炎症更活跃的患者外周血中Th17相关细胞因子表达更高［17］。此外，在HLA-27阳性葡萄膜炎患者的外周血样本中，也发现了Th17细胞的过度激活［18］。对于临床上由Th17细胞驱动的非感染性葡萄膜炎，本研究可能具有一定的临床意义，提示了高浓度葡萄糖摄入可能会带来炎症加重的风险，此类葡萄膜炎患者炎症期过多地摄入含糖量高的食品可能会加重病情。本研究也有不足之处，日常生活中人们的糖类暴露是长期积累的过程而非短期的刺激，由于EAU小鼠模型病程短和最适造模时间仅为6~8周龄的限制，本实验只能进行短期高浓度葡萄糖的刺激，并不能完全模拟人类日常生活中糖类摄入逐渐积累的过程。未来需要进一步研究来评估长期不健康的糖摄入是否会对葡萄膜炎患者眼内炎症的活动性造成影响。
综上所述，本研究结果显示，短期高浓度葡萄糖摄入可以加重EAU小鼠模型的炎症，增加眼内IL-17的表达，可能与外周血中Th17细胞的过度激活有关。本研究对由Th17细胞介导的非感染性葡萄膜炎患者的自我管理带来了启示，具有一定的临床意义。