《眼科新进展》  2021年10期 910-914   出版日期：2021-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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乳脂肪球表皮生长因子8（MFG-E8）对脂多糖诱导小胶质细胞炎症反应的抑制作用及其机制


视网膜变性疾病是一类致盲性眼病，具有家族遗传特性，进展缓慢且不可逆^［1］。近年来越来越多的实验研究显示,免疫系统介导的神经炎症反应在视网膜变性疾病中发挥重要作用^［2-3］。小胶质细胞是神经系统的固有免疫细胞，对神经系统发育、免疫微环境的调节具有重要作用^［4-6］。在视网膜变性过程中，小胶质细胞发挥了双刃剑的作用。一方面，活化的小胶质细胞能够吞噬细胞碎片等代谢性毒素物质发挥细胞免疫作用；另一方面，持续活化的小胶质细胞释放大量的促炎因子，引发炎症损伤反应，进而损害周围的神经细胞，加速视网膜变性进程。因此，调节小胶质细胞的免疫活性是视网膜变性疾病的重要治疗策略之一。
乳脂肪球表皮生长因子8（MFG-E8）是乳汁脂肪小球表面具有免疫源性的亲脂性糖蛋白^［7］。研究发现，在炎症反应、自身免疫性疾病、老年性疾病和肿瘤中，MFG-E8发挥多种功能^［8-10］。MFG-E8抑制Aβ42诱导的原代小鼠大脑小胶质细胞的炎症反应^［9,11］，外源性MFG-E8减少促炎细胞因子的释放进而保护外伤性脑损伤引起的神经元功能损害^［12］。炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素（IL）在小胶质细胞中的表达随着MFG-E8的增加或减少而增加或减少^［13］。本研究通过体外培养小胶质细胞来探讨MFG-E8对脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞炎症反应的作用及其机制。
1　材料与方法　
1.1　主要试剂　DMEM培养基、PDTC、LY294002（美国Sigma公司）；胎牛血清（FBS）（美国Genial公司）；LPS、2.5 g·L^-1胰蛋白酶、RIPA裂解液、细胞计数试剂盒-8、兔抗小鼠GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（碧云天生物技术有限公司）；MFG-E8、ELISA试剂盒（美国R&D公司）；兔抗小鼠NF-κB p65抗体、NF-κB p-p65抗体、Akt抗体、p-Akt抗体、PI3K抗体、p-PI3K 抗体、TNF-α抗体、IL-6抗体（英国Abcam公司）。
1.2　方法　
1.2.1　小胶质细胞的来源及培养　小胶质细胞（BV-2细胞）购于上海吉凯基因化学技术有限公司，培养于含体积分数10% FBS、10 g·L^-1青链霉素的DMEM培养液中，接种于T25培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中。隔天换液，待细胞生长融合至80%以上进行消化传代。
1.2.2　细胞活力测定　采用CCK-8法测定细胞活力。将BV-2细胞以每孔10×10³个接种于96孔板，每组设置3个复孔；待细胞贴壁后，分别用含有0 mg·L^-1、10 mg·L^-1、50 mg·L^-1、100 mg·L^-1和200 mg·L^-1的MFG-E8培养液继续培养24 h；加入10 μL WST-8溶液，37 ℃恒温箱中孵育4 h，测定450 nm波长处细胞的光密度。
1.2.3　实验分组　将培养处于对数期的BV-2细胞随机分5组，分别为：对照组:完全培养基培养的细胞；LPS组：含1 mg·L^-1 LPS的培养液培养的细胞；LPS+MFG-E8组：先用50 mg·L^-1 MFG-E8作用于BV-2细胞2 h后，再更换为含有1 mg·L^-1 LPS的培养液继续培养；LPS + LY294002组：先用含10 μmol·L^-1 的LY294002（PI3K-AKT信号通路抑制剂）培养液培养细胞2 h后，再更换为含有1 mg·L^-1 LPS的培养液继续培养；LPS + PDTC组：先用含10 μmol·L^-1 的PDTC（NF-κB信号通路抑制剂）培养液培养细胞2 h后，再更换为含有1 mg·L^-1 LPS的培养液继续培养。各组分组处理后继续培养48 h用于后续实验。
1.2.4　ELISA检测TNF-α表达　收集对照组、LPS组及LPS + MFG-E8组细胞上清液，根据TNF-α ELISA试剂盒的操作说明进行操作，450 nm波长处测量各组细胞的光密度，根据标准品浓度曲线计算出各组样品中TNF-α的实际质量浓度。
1.2.5　Western blot检测炎症因子表达及信号通路蛋白表达　收集对照组、LPS组、LPS+MFG-E8组、LPS+LY294002组和LPS + PDTC组细胞，冰上裂解提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，加上样缓冲液于水浴锅中加热进行蛋白变性。配置120 g·L^-1的分离胶和50 mg·L^-1的浓缩胶，将等量等质的蛋白样品加入上样孔行凝胶电泳，PVDF转膜，脱脂奶粉封闭，孵育一抗（NF-κB p65、NF-κB p-p65、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、TNF-α、IL-6及GAPDH，稀释浓度均为1∶1000），4 ℃摇床孵育过夜，二抗（稀释浓度为1∶1000）室温孵育1 h，凝胶成像仪曝光，用ImageJ软件分析荧光强度。
1.3　统计学方法　采用SPSS 24.0统计学软件进行分析，数据均呈正态分布，均采用x?±s表示。多组间的比较采用单因素方差分析检验，两组数据间的比较采用t检验。检验水准：α=0.05。
2　结果
2.1　不同浓度MFG-E8处理后细胞的活力　CCK-8法检测结果显示，经0 mg·L^-1、10 mg·L^-1、50 mg·L^-1、100 mg·L^-1、200 mg·L^-1 MFG-E8培养24 h后，各组BV-2细胞活力分别为（95.39±2.83）%、（93.88±2.84）%、（93.95±4.61）%、（94.22±3.72）%和（93.88±3.35）%，差异无统计学意义（F=0.099，P=0.980）。
2.2　MFG-E8对LPS诱导BV-2细胞形态的影响　光学显微镜下观察可见，对照组BV-2细胞呈静息状态，细胞大小均匀，呈长梭形，胞体细长，胞体两侧有细长的突起分支；LPS组BV-2细胞的胞体呈圆形，细胞表面的分支变短变粗，没有长的突起，呈阿米巴样；LPS+MFG-E8组BV-2细胞形态较LPS组有一定改善，部分细胞的胞体两侧伸出细长的分支（图1）。



2.3　MFG-E8对LPS诱导小胶质细胞炎症因子表达的影响　ELISA检测结果显示，对照组、LPS组及LPS+MFG-E8组细胞上清液中TNF-α的表达量分别为（111.16±4.25）ng·L^-1、（772.43±21.32）ng·L^-1和（235.10±45.67）ng·L^-1，总体比较差异有统计学意义（F=434.8，P<0.001）。两两比较结果显示，与对照组比较，LPS组BV-2细胞上清液TNF-α的表达量明显增高（t=52.68，P<0.001）；与LPS组比较，LPS+MFG-E8组BV-2细胞上清液TNF-α的表达量大幅度下降（t=18.47，P<0.001）。
Western blot检测结果显示，对照组、LPS组及LPS + MFG-E8组中TNF-α、IL-6蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义（F=8.999、53.190，P=0.016、0.000）。两两比较结果显示，与对照组比较，LPS组BV-2细胞中TNF-α、IL-6蛋白相对表达量均明显增高（均为P<0.05）；与LPS组比较，LPS+MFG-E8组BV-2细胞中TNF-α、IL-6蛋白相对表达量均明显下降（均为P<0.05）（图2）。



2.4　MFG-E8抑制LPS诱导小胶质细胞炎症反应的机制　对照组、LPS组、LPS+MFG-E8组、LPS+LY294002组、LPS+PDTC组5组BV-2细胞中炎症因子相关NF-κB信号通路p-p65蛋白及PI3K/Akt信号通路p-Akt、p-PI3K蛋白相对表达量差异均有统计学意义（均为P<0.05),而NF-κB p65、Akt、PI3K蛋白相对表达量5组间差异均无统计学意义（均为P>0.05)。两两比较结果显示，与对照组比较，LPS组BV-2细胞NF-κB p-p65蛋白相对表达量升高，p-Akt及p-PI3K蛋白相对表达量下降(均为P<0.001)。与LPS组比较，LPS+MFG-E8组BV-2细胞NF-κB p-p65蛋白相对表达量下降，p-Akt及p-PI3K蛋白相对表达量均升高(均为P<0.001)；与LPS组比较，LPS+LY294002组BV-2细胞NF-κB p-p65、p-Akt及p-PI3K蛋白相对表达量均无显著变化（均为P>0.05)；与LPS组比较，LPS+PDTC组BV-2细胞NF-κB p-p65蛋白相对表达量下降，p-Akt及p-PI3K蛋白相对表达量均升高（均为P<0.001）（图3、图4）。







3　讨论
小胶质细胞作为体内的固有免疫细胞，是中枢神经系统最重要的一道免疫防线。正常视网膜组织中小胶质细胞处于静息状态，有长的突起，维持视网膜内的神经系统稳态。当变性疾病发生时，小胶质细胞被迅速激活，突起消失，呈阿米巴样，发挥吞噬作用的同时释放大量的炎症因子TNF-α、IL-6等加重炎症反应^［14］。根据发挥作用的不同，活化的小胶质细胞可分为M1型和M2型。M1型细胞可产生大量炎症因子，从而破坏细胞外基质，进而破坏病原体及细胞的完整性，使其易于被吞噬^［15-16］；M2型细胞不仅能吞噬细胞碎片及代谢产物，而且能分泌抑制炎症的细胞因子，发挥保护机体的作用^［17］。适度的神经炎症反应对机体有一定的保护作用，但持续慢性的促炎因子的分泌会产生级联放大效应，加快疾病的发生发展^［5］。在本研究中，LPS激活小胶质细胞，使小胶质细胞由静息状态转变为阿米巴样状态，ELISA检测结果显示，BV-2细胞上清液TNF-α的含量增多，Western blot检测结果也显示，细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的表达增加。表明LPS诱导小胶质细胞表达，刺激炎症因子的分泌。干预小胶质细胞激活，减少促炎因子的释放，对防治神经炎症为主要病理的视网膜变性疾病具有重要意义。
MFG-E8是乳汁脂肪小球表面具有免疫源性的亲脂性糖蛋白，主要分布于乳腺小管顶端的分泌细胞，也存在于巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、树突状细胞以及胰腺细胞等^［7］。在炎症反应、自身免疫性疾病、老年性疾病和肿瘤中，MFG-E8在缓解炎症、改善预后、促进伤口愈合、动脉重塑、增强致瘤性和肿瘤代谢中发挥多种功能^{［8,10,18］}。在小鼠模型中，重组MFG-E8能抑制内毒素诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子的分泌，并通过降低炎症介质的产生发挥抗炎作用^［19-20］。本研究采用CCK-8法检测不同浓度MFG-E8作用下小胶质细胞的生存活力，结果显示，不同浓度MFG-E8作用下小胶质细胞的生存活力没有明显差异。当MFG-E8作用于LPS诱导的BV-2细胞后，小胶质细胞炎症因子TNF-α及IL-6的分泌减少，细胞的炎症反应降低。以上研究结果说明，MFG-E8可明显抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应。
在动物模型及体外模型研究中发现，小胶质细胞在诱导因素刺激作用下，NF-κB等炎症相关信号通路被激活，释放炎症因子，重组MFG-E8能通过降低NF-κB的核转录下调下游炎症介质的产生而发挥抗炎作用^［19-20］。Shi等^［9］认为，MFG-E8通过降低NF-κB及上调PI3K-Akt的表达抑制Aβ42诱导的原代小鼠大脑小胶质细胞的炎症反应，进而降低细胞毒性，为阿尔茨海默病的治疗提供理论基础。本研究发现，LPS可以诱导NF-κB信号通路的激活，同时抑制PI3K/Akt信号通路的活性；而MFG-E8作用下，与LPS组相比，NF-κB信号通路蛋白因子p-p65的表达下降，而PI3K/Akt信号通路蛋白因子p-Akt和p-PI3K的表达均升高。当NF-κB信号通路抑制剂PDTC联合LPS作用于BV-2细胞时，NF-κB p-p65蛋白的相对表达量降低，同时p-Akt和p-PI3K蛋白的相对表达量升高；当PI3K信号通路抑制剂LY294002联合LPS作用于BV-2细胞时，p-Akt和p-PI3K蛋白的相对表达量均降低，但NF-κB p-p65蛋白的相对表达量没有明显变化。根据以上结果，我们推断MFG-E8主要通过抑制NF-κB信号通路发挥作用。
综上，本研究结果显示，MFG-E8对LPS诱导的小胶质细胞炎症反应有抑制作用，其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。本研究为开发延缓和阻止视网膜变性疾病发生发展的药物提供了参考依据。