《眼科新进展》 2021年10期
905-909
出版日期：2021-10-05
ISSN:1003-5141
CN:41-1105/R
GPR120通过抑制核因子-κB信号通路对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞损伤的保护作用
视网膜神经节细胞(RGC)损伤是糖尿病视网膜病变(DR)发生发展的重要机制之一，可表现为RGC凋亡甚至死亡［1-2］，严重影响患者的视力。研究发现，视网膜炎症和RGC凋亡对DR进展尤为重要，相关的抗炎、抗凋亡治疗策略可能是改善DR的潜在靶点［3-4］。G蛋白偶联受体(GPCRs)家族能调控多种生理病理学改变，其中包括游离脂肪酸受体GPR120［5］。GPR120在神经损伤等相关疾病中显现出很强的神经保护效果［6-7］。GPR120在体内被激活后，可与β-arrestin2 结合，通过核因子-κB(NF-κB)通路发挥明显抗炎作用［8］。除此之外，激活GPR120亦能调控P13K/AKT或ERK信号通路以抵抗凋亡对疾病的影响［9］。GPR120激活后可通过抑制炎症和细胞凋亡来预防局灶性小鼠脑缺血性损伤［7］。对高脂高糖喂养的小鼠给予亚麻籽油饮食(富含omega-3脂肪酸，omega-3为GPR120通路激活剂)8周后，小鼠体重增加，且胰岛素敏感性升高［10］，而GPR120对糖尿病状态下RGC的影响尚未见报道。因此，本研究欲探讨激活GPR120对糖尿病状态下RGC损伤的保护作用，为其应用于DR防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂及仪器 链脲佐菌素(STZ; 美国Sigma公司)；鱼油(美国Nature’s Bounty Inc公司)；GPR120、 NF-κB、半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase-3)一抗 (英国Abcam公司)；HE染色试剂盒、二十二碳六烯酸(DHA)含量试剂盒、二十碳五烯酸(EPA)含量试剂盒、Western blot二抗(北京碧云天公司)。荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；冰冻切片机(德国SLEE公司)；水平电泳仪(美国BIO-RAD公司)。
1.1.2 动物来源及分组处理 SPF级健康雄性SD大鼠60只，6周龄，体重180~240 g，购自锦州医科大学［SCXK(辽)2015-18］。大鼠按55 mg·kg-1腹腔一次性注射 STZ诱导糖尿病模型，72 h采尾静脉血测血糖，将血糖浓度大于16.7 mmol·L-1的大鼠定为模型诱导成功［11］。糖尿病大鼠随机分成三组：糖尿病组、鱼油预处理组、安慰剂组，每组15只，另15只正常大鼠作为对照组。其中，鱼油预处理组大鼠为成模后使用鱼油(鱼油的主要成分为omega-3，占30%)灌胃，给药剂量参考文献［9］，为每日1次，每次1 g·kg-1；安慰剂组大鼠为成模后灌胃玉米油，剂量为1 g·kg-1，每日1次；对照组、糖尿病组大鼠灌胃等剂量PBS缓冲液，均为每日1次。12 周后进行各项指标检测。实验动物的使用遵循国家《实验动物管理条例》。
1.2 方法
1.2.1 样本制备 12 周后，每组随机各取5只大鼠使用40 g·L-1多聚甲醛灌胃处死，取出双侧眼球并进行石蜡包埋、切片，切片厚度为5 μm，用于HE染色及免疫荧光染色。每组另随机各取5只大鼠处死，摘取双眼视网膜，剪碎、超声处理，4 ℃ 2000 r·min-1离心30 min后取上清，用于Western blot检测。每组剩余大鼠处死后，摘取视网膜组织，按照试剂盒说明书进行气相色谱分析，检测视网膜组织中DHA和EPA含量。
1.2.2 气相色谱法分析视网膜组织中DHA和EPA含量 快速分离出视网膜，粉碎制样。每个视网膜加2 mL混合液（氯仿∶甲醇=1∶2），静止后待酯化；标准品：取0.5 mL EPA和DHA标准品混匀，加入1滴酚酞指示剂，混匀待酯化；酯化：样品和标准品分别加入0.2 mL三乙胺，60 ℃水浴10 min，最终所得的酯化物用于色谱分析，记录各组大鼠视网膜组织DHA、EPA含量。
1.2.3 HE染色检测RGC密度 切片常规脱蜡至水，PBS洗3次；苏木素浸染2 min，自来水冲洗；伊红浸染1 min，自来水冲洗；脱水透明后封片，ImageJ软件计数RGC数量及视网膜面积，二者之比即为RGC密度。
1.2.4 免疫荧光染色检测视网膜GPR120蛋白表达 切片常规脱蜡至水，高压抗原修复2.5 min，切片于PBS中洗涤3次，每次5 min；体积分数0.3% Triton X-100摇床30 min；PBS洗涤3次，每次5 min；体积分数10%山羊血清室温孵育30 min；不洗，滴加兔抗大鼠GPR120 (1∶400)，4 ℃过夜；PBS洗涤3次，每次3 min；滴加荧光二抗，室温30 min；PBS洗涤3次，每次3 min；含DAPI的封片剂封片，荧光显微镜拍照，测定光密度。
1.2.5 Western blot检测视网膜GPR120、NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量 BCA法测定蛋白浓度，电泳时加入12 μL样品；电泳、转膜后10 g·L-1牛血清白蛋白室温封闭2 h；加入一抗(兔抗大鼠GPR120，1∶5000；兔抗大鼠NF-κB，1∶8000；小鼠抗大鼠Caspase-3，1∶10 000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤4次，每次5 min；加入二抗2 h，TBST洗4次，每次5 min；化学发光法(ECL)显影，ImageJ软件分析灰度值。
1.3 统计学方法 数据采用SPSS 20.0 统计软件进行分析，整体比较采用F检验，两两比较采用LSD检验，所有数值以均数±标准差表示。检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 视网膜组织中DHA、EPA含量 与对照组相比，糖尿病组及安慰剂组大鼠视网膜组织中DHA、EPA含量均明显减少，鱼油预处理组大鼠视网膜组织中DHA、EPA含量均明显增加(均为P<0.01)；与糖尿病组相比，鱼油预处理组大鼠视网膜组织中DHA、EPA含量均明显增加(均为P<0.01)；糖尿病组与安慰剂组间大鼠视网膜组织中DHA、EPA含量差异均无统计学意义(均为P＞0.05)(表1)。
2.2 各组大鼠RGC密度 与对照组相比，糖尿病组及安慰剂组大鼠RGC密度均明显降低(均为P<0.01)；与糖尿病组相比，鱼油预处理组大鼠RGC密度明显增加(P<0.01)；糖尿病组与安慰剂组间大鼠RGC密度差异无统计学意义(P＞0.05) (表1，图1)。
2.3 各组大鼠视网膜GPR120蛋白表达 免疫荧光染色检测结果显示，GPR120 主要分布于大鼠视网膜RGC层 (图2)。与对照组相比，糖尿病组及安慰剂组大鼠视网膜GPR120光密度均明显降低(均为P<0.01)；与糖尿病组相比，鱼油预处理组大鼠视网膜GPR120光密度明显增加(P<0.01)；糖尿病组与安慰剂组间大鼠视网膜GPR120光密度差异无统计学意义(P＞0.05)(表2)。
2.4 各组大鼠视网膜GPR120、NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量 与对照组相比，糖尿病组及安慰剂组大鼠视网膜GPR120蛋白相对表达量均明显降低，NF-κB及Caspase-3蛋白相对表达量均明显增加(均为P<0.01)；与糖尿病组相比，鱼油预处理组大鼠视网膜GPR120蛋白相对表达量明显增加，NF-κB及Caspase-3蛋白相对表达量均明显降低(均为P<0.01)；糖尿病组与安慰剂组间大鼠视网膜GPR120、NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量差异均无统计学意义(均为P＞0.05) (表2，图3)。
3 讨论
RGC轴突形成视神经，RGC受损可明显降低患者的视力，如何对RGC的损伤进行早期的防治尤为重要［12］。DHA和EPA 为omega-3的主要成分，二者富含在鱼油中，可发挥重要的抗炎作用。omega-3对多种疾病，如糖尿病、神经退行性病变等均具有较好的效果［13］。有文献报道，omega-3对中风预后及神经元损伤具有很好的保护作用［14］。而糖尿病状态下视网膜损伤也是一种神经退行性病变，推测omega-3可能对其具有治疗作用。本研究发现，糖尿病组大鼠造模后12周RGC密度下降，细胞凋亡率增加，说明造模成功，与本课题组前期研究结果一致［15］。而糖尿病大鼠给予鱼油灌胃12周后，视网膜组织中DHA和EPA含量均明显增加，而此时RGC密度也明显增加，提示鱼油可通过上调视网膜组织中DHA和EPA含量，进而增加RGC的密度。在轻度应激诱发的抑郁症模型中，喂食动物EPA或DHA后，可有效降低应激诱导的NF-κB高表达，抑制凋亡相关信号转导［16］。此外，EPA、DHA具有强烈的抗炎特性，能有效改善卒中预后，降低发生心血管疾病的风险［17］。提示EPA、DHA具有很强的神经保护作用。而DR本身为一种神经退行性疾病，本研究证实了鱼油治疗DR的可能性，因此，对其机制的进一步探索很有必要。
文献证实，GPR120可直接或间接调节胃肠道和胰腺的激素分泌，并调节脂肪、肝脏和肌肉组织中的脂质和（或）葡萄糖代谢，此外，GPR120被认为在脂肪和巨噬细胞中具有介导抗炎和胰岛素增敏作用［18］。这些益处表明，GPR120激动剂有可能成为治疗肥胖、糖尿病的有效药物。有文献报道，GPR120是鱼油发挥作用的重要靶点［19］，omega-3激活GPR120后对下丘脑神经元损伤具有显著的抗炎效果［20］。GPR120还可调节巨噬细胞介导的炎症反应，对2型糖尿病小鼠的症状具有缓解作用［21］。此外，激活GPR120能抵抗由肿瘤坏死因子-α引起的NF-κB的炎症级联反应［22］。本研究结果显示，大鼠糖尿病状态下，GPR120蛋白相对表达量明显降低，NF-κB蛋白相对表达量明显增加，RGC密度降低，这提示GPR120活性在糖尿病时被明显抑制，不足以对抗糖尿病状态下视网膜的炎症损伤，进而引起RGC的受损；而给予鱼油灌胃12周后，大鼠视网膜组织中DHA和EPA含量均明显增加，GPR120蛋白相对表达量明显增加，NF-κB蛋白相对表达量明显下降，RGC密度增加，提示鱼油可显著激活GPR120通路，可能通过调控NF-κB炎症级联反应进而对抗RGC的损伤。此外，本研究进一步对视网膜Caspase-3蛋白进行了检测，结果显示，鱼油灌胃治疗后，随着Caspase-3蛋白相对表达量的降低，RGC密度明显增加。
综上所述，本研究发现鱼油可激活糖尿病大鼠视网膜GPR120蛋白表达，进而通过抗炎和抗凋亡机制对抗RGC的损伤。但因糖尿病致病机制复杂，本研究仍存在一些不足，如未能在基因层面检测视网膜GPR120基因的变化，未能对GPR120抗炎、抗凋亡的机制进行深入探讨等，这将在本课题的下一步计划中继续研究。