《眼科新进展》  2021年7期 638-642   出版日期：2021-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
槲皮素对转化生长因子β1介导的视网膜色素上皮细胞上皮-间质转化过程的影响


增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是一种能造成视力损害的疾病。PVR的发展过程包括视网膜色素上皮（RPE）细胞和胶质细胞增殖迁移，增殖膜的形成和收缩，细胞外胶原蛋白的产生和视网膜皱褶的形成等几个步骤［1］。上皮-间质转化在PVR的进展中起着重要作用。经多种因素刺激后，极化上皮细胞转化为间充质细胞，产生细胞外基质，同时改变了细胞形态和分子特征［2］。研究表明，PVR患者玻璃体中存在多种生长因子和细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、转化生长因子-β（TGF-β）和表皮生长因子［3］。TGF-β1在RPE细胞的上皮-间质转化过程中起着重要的作用［4-5］。TGF-β1诱导的上皮-间质转化过程导致RPE细胞从上皮表型细胞转变为具有间充质特征的细胞，使其增殖、迁移、胶原蛋白分泌增强，加速了上皮-间质转化的进程。近年来，研究者们提出了一些在体外和体内逆转上皮-间质转化的治疗方法，包括黄酮类化合物的应用和基因沉默等。
槲皮素是从余甘子等植物中提取的一种天然的多酚类黄酮化合物［6］。研究发现，槲皮素具有抗氧化［7］、抗炎［8］、抗菌［9］、抗新生血管生成［10-11］、抗肿瘤［12-13］等多种作用。此外，槲皮素对各种眼病，如老年性黄斑变性［14］、糖尿病性白内障［15］、干眼［16］、视网膜母细胞瘤［11］也有治疗效果。Xu等［17］研究发现，槲皮素可以通过激活Nrf2通路来保护氧化损伤的细胞。Du等［15］ 研究发现，槲皮素可以通过抑制TGF-β/PI3K/Akt通路减轻RPE细胞上皮-间质转化。本研究探讨槲皮素对TGF-β1介导的RPE细胞增殖、迁移、I型胶原蛋白含量、上皮-间质转化相关标志物表达以及Smad信号通路的影响。
1　材料与方法　
1.1　实验材料　人RPE细胞系（ARPE-19细胞）（上海iCell 公司），DMEM/F-12培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，TGF-β1 (美国PeproTech公司)，槲皮素(美国Sigma-Aldrich公司),CCK-8试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司），孔径8 mm Transwell小室(美国Corning公司)，ELISA试剂盒(上海赛格生物科技有限公司)，BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，奥德赛双色红外激光成像系统(美国LI-COR生物公司)，紧密连接蛋白ZO-1、α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA)、E-钙黏合素、N-钙黏合素、Smad2/3和GAPDH 抗体 (美国CST公司) 。
1.2　方法　
1.2.1　细胞培养与处理　将ARPE-19细胞置于含体积分数10%胎牛血清、100 U·mL-1青链霉素的DMEM/F12培养基中，放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中进行培养，每2~3 d更换一次培养基，待细胞覆盖达到60% ~ 70%后，用无血清的DMEM/F-12培养基处理细胞24 h，模拟实验前的细胞饥饿状态。分别使用0 mg·L-1、2.5 mg·L-1、5.0 mg·L-1、7.5 mg·L-1、10.0 mg·L-1、12.5 mg·L-1 及15.0 mg·L-1 的TGF-β1和0 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、60 μmol·L-1、75 μmol·L-1及100 μmol·L-1槲皮素处理ARPE-19细胞24 h和48 h，进行作用最佳浓度筛选。依据浓度筛选结果最终设置4个组：对照组、10.0 mg·L-1TGF-β1组、10.0 mg·L-1TGF-β1+25 μmol·L-1槲皮素组、10.0 mg·L-1TGF-β1+50 μmol·L-1槲皮素组。
1.2.2　细胞活性分析　采用CCK-8法测定细胞活性。以每孔2000个细胞密度将细胞置入96孔板，在不含血清的 DMEM/F-12培养基中保持饥饿状态12 h，然后用不同浓度的TGF-β1刺激并用槲皮素干预，按上述方法孵育细胞24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8避光孵育2 h，在波长450 nm处测量各孔光密度。以各组处理前细胞活性为参照计算细胞存活率。
1.2.3　Transwell实验　将4组细胞接种于200 μL不含血清的 DMEM/F-12培养基，置入Transwell培养系统的上室中，下室加入含100 g·L-1胎牛血清的培养基。培养18 h后，用棉签清除未迁移细胞。PBS洗涤后，底膜上的迁移细胞用乙醇固定20 min，在空气中干燥后用10 g·L-1结晶紫染色15 min，在相差显微镜下采集图像。
1.2.4　ELISA检测细胞中I型胶原蛋白含量　将细胞以每孔200×103的密度接种于6孔板中，各组细胞皆培养48 h，收集上清液，在492 nm处测定细胞中I型胶原蛋白含量，数值用标准曲线计算。
1.2.5　Western blot检测ARPE-19细胞上皮-间质转化标志物表达及Smad2/3磷酸化　采用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，提取总蛋白，4 ℃条件下将裂解液12 000 r·min-1离心10 min后收集上清液，测定总蛋白浓度。用核蛋白和胞质蛋白提取试剂盒分离细胞质和核蛋白，并使用BCA法进行定量检测。蛋白质经电泳转膜后，转移到NC膜上。将膜置于50 g·L-1脱脂牛奶中封闭1 h，然后加入一抗(稀释1∶1000)，在4 ℃孵育过夜。一抗包括细胞质紧密连接蛋白ZO-1、α-SMA、E-钙黏合素、N-钙黏合素、Smad2/3和GAPDH抗体。分别在PBST缓冲液中洗涤3次，每次10 min，室温下用羊抗兔二抗孵育45 min。采用奥德赛双色红外激光成像系统对膜进行扫描。
1.3　统计学分析　本研究数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　不同处理时间各组细胞存活率　对照组、10.0 mg·L-1TGF-β1组、10.0 mg·L-1TGF-β1+25 μmol·L-1槲皮素组、10.0 mg·L-1TGF-β1+50 μmol·L-1槲皮素组处理ARPE-19细胞24 h后，细胞存活率依次为1.00±0.07、1.30±0.04、1.23±0.03、1.05±0.04；处理细胞48 h后，细胞存活率依次为1.00±0.04、1.69±0.07、1.24±0.05、1.02±0.02。无论处理细胞24 h或48 h，10.0 mg·L-1TGF-β1组细胞存活率均高于其他各组（均为P<0.05）；10.0 mg·L-1TGF-β1+25 μmol·L-1槲皮素组细胞存活率均高于10.0 mg·L-1TGF-β1+50 μmol·L-1槲皮素组（均为P<0.05）。
2.2　不同处理时间各组细胞迁移数　对照组、10.0 mg·L-1TGF-β1组、10.0 mg·L-1TGF-β1+25 μmol·L-1槲皮素组、10.0 mg·L-1TGF-β1+50 μmol·L-1槲皮素组处理ARPE-19细胞24 h后，细胞迁移数依次为164.00±28.48、457.00±22.11、316.67±30.55和161.33±32.96；处理ARPE-19细胞48 h后，细胞迁移数依次为259.67±29.09、422.00±38.00、186.00±55.57 和152.33±20.65。无论处理细胞24 h或48 h，10.0 mg·L-1TGF-β1组细胞迁移数均多于其他各组（均为P<0.05）；10.0 mg·L-1TGF-β1+25 μmol·L-1槲皮素组细胞迁移数均多于10.0 mg·L-1TGF-β1+50 μmol·L-1槲皮素组（均为P<0.05）（见图1）。
2.3　槲皮素对TGF-β1处理的ARPE-19细胞I型胶原蛋白含量的影响　10 mg·L-1 TGF-β1处理细胞48 h后，培养基上清液I型胶原蛋白含量升高（P<0.05），而加入不同浓度槲皮素均能够有效抑制I型胶原蛋白含量的升高（均为P<0.05）（见图2）。
2.4　槲皮素对TGF-β1处理的ARPE-19细胞上皮-间质转化标志物表达的影响　10 mg·L-1 TGF-β1处理细胞48 h后，细胞N-钙黏合素和α-SMA的表达增高，而槲皮素以浓度依赖的方式显著降低了TGF-β1所引起的N-钙黏合素和α-SMA的表达增高作用。此外，在10 mg·L-1 TGF-β1处理细胞48 h后，紧密连接蛋白ZO-1和E-钙黏合素的表达明显减少，而加入槲皮素后紧密连接蛋白ZO-1和E-钙黏合素的表达增高（见图3）。
2.5　槲皮素对ARPE-19细胞上皮-间质转化过程中Smad信号通路的影响　Smad信号通路被认为是上皮-间质转化的重要信号通路。10 mg·L-1 TGF-β1处理细胞48 h后，Smad2/3磷酸化显著增加，促进上皮-间质转化过程，而不同浓度槲皮素可以抑制Smad2/3磷酸化（见图4）。







3　讨论　
槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗血管生成、抗肿瘤等多种有益特性。2011年，Kviecinski等［18］报道了槲皮素作为氧自由基清除剂能有效抑制氧化应激。Feng等［19］发现槲皮素可以通过调控E-钙黏合素的表达来抑制上皮-间质转化，增加E-钙黏合素的表达，恢复细胞与细胞间的黏附，抑制上皮-间质转化进展。在眼科疾病方面，槲皮素具有很强的抗氧化和螯合性，可保护晶状体免受氧化损伤，防止白内障的发生［20］。本研究结果表明，槲皮素通过调节Smad2/3磷酸化来抑制TGF-β1介导的RPE细胞的上皮-间质转化过程，槲皮素可以作为治疗PVR的一种潜在药物。
RPE细胞迁移在PVR的发展中发挥至关重要的作用，在本研究中我们发现，槲皮素具有改善TGF-β1介导的 RPE细胞增殖、迁移和胶原蛋白分泌的作用。首先，槲皮素处理细胞24 h和48 h可以有效地抑制TGF-β1介导的细胞增殖。其次，TGF-β1能促进RPE细胞迁移，而槲皮素以浓度依赖的方式抑制RPE细胞迁移。此外，槲皮素还降低了RPE细胞I型胶原蛋白含量，抑制了细胞上皮-间质转化进程。
在本研究中，经槲皮素处理ARPE-19细胞后，细胞紧密连接蛋白ZO-1和E-钙黏合素表达上调，有助于维持RPE细胞的正常功能。细胞连接的丧失在上皮-间质转化的进展中起着至关重要的作用，而E-钙黏合素作为细胞黏附的关键介质参与了上皮-间质转化。在上皮-间质转化过程中，α-SMA和N-钙黏合素表达上调，槲皮素对于这些标志物的调控将会控制上皮-间质转化过程。本研究结果显示，在TGF-β1刺激下Smad2/3通路的磷酸化受控于槲皮素，这表明槲皮素能通过调节Smad2/3通路来阻止上皮-间质转化的发生。
TGF-β/Smad信号通路涉及PVR［21］、多器官纤维化［22-24］、癌症［25-26］等多种疾病。TGF-β诱导了Smad2/3通路的活化和磷酸化，而Wu等［27］的研究表明槲皮素在肝纤维化动物模型中具有抑制Smad信号通路的作用，本研究结果也与此一致。另外，Xin等［28］也认为，使用浓度为1 μmol·L-1、3 μmol·L-1和10 μmol·L-1的槲皮素孵育细胞48 h可以有效地调控Smad2/3激活过程，对糖尿病大鼠的肾脏纤维化起保护作用。Lu等［29］研究发现槲皮素可以通过使TGF-β1/Smad2/3信号通路失活，减少细胞外基质的产生，从而改善肾损伤。
本研究也存在一些局限之处。首先，我们研究了槲皮素对RPE细胞上皮-间质转化过程的影响及其机制，但并未建立PVR动物模型；第二,我们阐明了槲皮素通过Smad信号通路影响TGF-β1介导的上皮-间质转化过程的机制，上皮-间质转化还涉及其他信号通路，本研究未涉及。因此，未来我们应进一步研究槲皮素在细胞系和PVR动物模型中的作用机制，以确定其潜在作用效果。
综上所述，槲皮素能够显著抑制TGF-β1介导的RPE细胞增殖、迁移和胶原蛋白分泌，这表明槲皮素是一种潜在的PVR治疗药物。但在槲皮素应用于临床前，我们仍需进一步深入研究其作用机制。