《眼科新进展》 2021年7期
628-632
出版日期：2021-07-05
ISSN:1003-5141
CN:41-1105/R
OCTA与FFA在小鼠脉络膜新生血管模型中应用的比较研究
脉络膜新生血管（CNV)是年龄相关性黄斑变性的主要病理基础，发达国家90%视力减退和致盲都源于CNV，异常增殖的新生血管突破Bruch膜是其主要的病理生理基础［1］。CNV对视力影响大、预后差，其治疗、诊断和预防逐渐成为现在的研究热点。动物模型中应用激光损伤小鼠Bruch膜可观察到异常增殖的新生血管突破Bruch膜进入视网膜下，可成功模拟CNV的病理形态，成为研究CNV的理想动物模型［2］。
荧光素眼底血管造影（FFA）是最早应用于CNV的诊断技术之一，且被认为是诊断的金指标。但FFA为有创性检查，存在造影剂过敏的风险，因此限制了该技术的应用范围。海德堡眼底造影系统不仅可用于眼底血管造影检测，同时可作为非侵入性设备拍摄眼底彩色照片，以及进行红外眼底成像、绿激光眼底成像、蓝激光眼底成像，可为眼底疾病的诊断提供不同的视角。本研究使用海德堡Spectralis HRA多种眼底成像结果作为FFA的对照，进一步描述CNV形态，并排除由其他疾病引起的结果偏差。光学相干断层扫描血管成像（OCTA）仪作为非侵入性的检查设备，相对于传统的检查设备更加快捷、简便；除可获得血管的结构信息之外，还能够分层观察视网膜脉络膜的血管形态及血流改变的情况，对于CNV的重新认识和诊断均具有重要的意义［3-5］。Carlo等［6］和Bonini等［7］研究发现，OCTA检查对CNV诊断的敏感度为50%~100%，特异性可达到92%~100%。然而 FFA与OCTA相比，哪种技术能更好地描述CNV的形态仍未可知。因此，本研究以免疫组化脉络膜铺片作为金标准，对比在激光诱导制作的小鼠CNV模型中FFA和OCTA 两种检查技术诊断CNV的准确性。
1 材料与方法
1.1 材料 10只MacGreen［B6N Cg-Tg(Csf1r-EGFP)1 Hume/J］杂合小鼠，鼠龄6~8周，雄性，体质量180~200 g，来自西安交通大学实验动物中心。小鼠置于恒温动物房中进行饲养，相对湿度为55%~70%，12 h/12 h昼夜环境交替并保证充足的食物以及水分来源。所有动物饲养条件及饮食标准均遵从ARVO的《实验动物管理及使用指南》标准进行。
1.2 主要试剂及仪器 美托咪定（1 g·L-1; Provet AG, 瑞士），氯胺酮（50 g·L-1; Parke-Davis, 瑞士），900型裂隙灯（BM900; Haag-Streit AG, 瑞士），532 nm激光机（Carl Zeiss Meditec AG, 德国），复方托吡卡胺（1 mL∶5 mg；参天制药，日本），OCTA仪（Zeiss Cirrus HD-OCT 5000，德国），海德堡Spectralis HRA共焦激光同步血管造影系统 (Heidelberg Engineering GmbH, 德国)，100 g·L-1荧光素钠（爱尔康公司，美国），TritonX-100 溶液 (Sigma-Aldrich公司，美国)，山羊血清（Wiesentheid, 德国）, Iba-1（1∶500；Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, 日本），羊抗兔IgG（H+L）(Alexa Fluor 594;Thermo Fisher Scientific)，羊抗鸡多克隆抗体IgY（H+L）(FITCH；Abcam)。
1.3 麻醉方法 在实验开始后第7、14天分别麻醉小鼠，10只小鼠按照1 mg·kg-1 颈后皮下注射美托咪定（1 g·L-1）以及80 mg·kg-1 氯胺酮（50 g·L-1）腹腔注射。小鼠麻醉后用电热毯保持体温直至苏醒。
1.4 CNV动物模型制作 CNV模型由激光击穿Bruch膜制作。将麻醉满意的小鼠置于平台上，放置于裂隙灯前。激光应用532 nm激光机。术前应用复方托品酰胺（1 mL∶5 mg，滴眼数次直至瞳孔开大直径约1.5 mm）进行散瞳。将接触式眼底镜置于小鼠角膜前，将激光引入眼底。于每只小鼠左眼视神经周围行3点激光光凝(光斑直径50 μm, 光斑强度300 mW, 曝光时间100 ms )。激光光凝成功的标准是观察到激光斑前有少量气泡产生。小鼠双眼涂抗生素眼膏保持湿润。在激光造模后第7天、第14天对10只小鼠进行眼底照相、FFA以及OCTA检查。
1.5 OCTA检查 在激光造模后的第7、14天应用OCTA仪进行小鼠眼底扫描成像。将28 D透镜放置于OCTA仪器前，将麻醉满意小鼠散瞳后置于OCTA仪器前，选择扫描视神经附近3 mm×3 mm范围，并包绕所有激光斑。应用OCTA仪对小鼠浅层视网膜以及深层视网膜进行扫描；最终选取在脉络膜层面的激光斑。
1.6 眼底多重影像拍摄及FFA检查 小鼠激光造模后第7、14天完成OCTA检查之后再行FFA检查。将麻醉满意的10只小鼠放置于操作台前，应用102°广角透镜及海德堡Spectralis HRA共焦激光同步血管造影系统进行眼底多种影像拍摄（包括红外眼底成像、蓝色眼底成像以及绿色眼底成像）。接着将1 g·L-1荧光素钠于每只小鼠皮下注射50 μL，迅速调整设备进行FFA检查，注射造影剂至少5 s后进行小鼠眼底后极部FFA检查。
1.7 小鼠眼球脉络膜铺片 10只小鼠完成所有FFA检查后，采用CO2窒息法处死小鼠，摘除左眼眼球并置于40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定10 min，剪除角膜及晶状体，将视网膜及RPE-脉络膜-巩膜混合体再继续固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液中50 min。然后小心分离视网膜及RPE-脉络膜-巩膜混合体，并用含体积分数0.5% TritonX-100的PBS溶液冲洗。冲洗完成后，在室温下将标本在含体积分数0.5%TritonX-100、体积分数10%山羊血清的PBS 中浸泡2 h。加入一抗:凝集素（Isolectin GS-IB4）、浓度为1∶100；兔多克隆抗体Iba-1，浓度为1∶500；鸡多克隆抗 GFP抗体，浓度为1∶300，并放置于摇床上，4 ℃过夜。第2天，将标本浸入含体积分数0.2% Triton X-100、体积分数10%山羊血清的PBS溶液中，并加入二抗，室温放置2 h，二抗如下：羊抗兔IgG（H+L)以及羊抗鸡多克隆抗体IgY（H+L）(1∶200)。 最后将标本冲洗并剪成花瓣状，将脉络膜组织平铺于玻璃载玻片上，并封片。
1.8 数据标准化及读取 应用软件ImageJ描画出激光斑的面积。测量激光造模后第7、14天在几种影像模式下（红外、绿色、蓝色眼底成像，FFA以及OCTA）的激光斑面积。
首先测量脉络膜铺片并计算激光斑面积，方法如下：可设定1 mm红色比例尺作为标准比例尺。设定标准比例尺之后，手动描记出激光斑的边缘，软件ImageJ会自动计算激光斑的面积。激光眼底成像、FFA及OCTA不提供比例尺，因此在测量上述图片中的数据前，首先要对图片的比例尺作标准化处理，方法如下：首先在脉络膜铺片照片上找到一根易于辨认的血管，测量其长度，并在FFA图片上找到相应的血管，测量同样的距离，用已知血管长度作为比例尺，这样就可得到FFA检查的激光斑面积。同法也可以检查并计算OCTA以及眼底多重影像成像照片上的激光斑面积。
1.9 统计学分析 应用统计软件R语言4.0.2进行统计学处理。所有数据输入并求出中位数、方差、标准差(最大值、最小值、四分位数）。应用组内相关系数（ICC）分析方法来检验FFA、OCTA及眼底多种影像成像与脉络膜铺片结果的一致性。
2 结果
2.1 不同设备及方法检测的小鼠左眼激光光斑面积 经过数据标准化处理以及ImageJ生物绘图软件的测算，应用不同检查设备（多重影像眼底成像、OCTA、FFA）检测10只小鼠左眼的激光光斑面积见表1。
2.2 小鼠CNV模型中OCTA与脉络膜铺片的一致性分析 OCTA图像上可见到新生血管形态（图1A、B），同样，在脉络膜铺片照片中，激光斑的形态亦非常明显（图1C）。OCTA检查显示，造模后第14天激光斑面积略小于造模后第7天激光斑面积（图1A、B）。一致性分析结果显示，OCTA与脉络膜铺片之间的一致性较差（P=0.700）（见表2）。
2.3 小鼠CNV模型中多重影像技术、FFA与脉络膜铺片的一致性分析 应用多重影像技术（包括红外眼底成像、绿色眼底成像以及蓝色眼底成像）（见图2）以及FFA（见图3）选取激光造模后第7、14天的眼底成像，并最终将造模后第14天的激光斑面积与脉络膜铺片结果作比较发现，在多重激光眼底成像图上可明显观察到激光斑，并未见其他眼底疾病。FFA及多重激光眼底成像均可描述激光斑的形态，且造模后第14天的激光斑面积略小于造模后第7天激光斑面积（与OCTA所显示的趋势一致）。经过一致性分析发现，FFA与脉络膜铺片的一致性较高（P=0.003、0.037)（见表2）。
结果显示，FFA（包括早期及晚期）、多重眼底成像的一致性较为显著，而OCTA的一致性最不显著。在一致性分析显著的四种检查中，与金标准一致性最相关的是FFA早期，然后依次是眼底彩照、FFA晚期及红外眼底成像。结果显示，FFA比OCTA具有更好的一致性。
3 讨论
FFA曾经作为眼底影像诊断的金标准，被广泛应用于眼科的实验与临床中，它可观察造影剂沿血管的循环以及渗漏，较好地显示微血管瘤、眼底新生血管以及无灌注区。FFA在检查过程中需要静脉注射造影剂，会引起部分患者出现不良反应。另外，浅层毛细血管与深层毛细血管在FFA显影中可能会重叠，使FFA不能清晰显示视网膜深层及脉络膜结构［8］。而OCTA能更加细致地描绘视网膜的深层血管形态以及黄斑部的组织结构形态，因此大有取代传统FFA的趋势。OCTA因可对视网膜及脉络膜的血流变化进行检测，并应用特殊算法求得眼底血管的伪影，以及具有非侵入性以及检查快速的优点，现得到了广泛的应用，成为诊断眼底疾病的重要工具。尤其是OCTA具有非侵入性的特点，使其在最近一段时间的利用率高于FFA。OCTA甚至在某些眼底疾病中的有效性和特异性也高于FFA［9-11］。应用OCTA可为患者的随访以及预后提供参考，并且对于选择CNV的治疗时机具有指导作用［12］。 OCTA可对视网膜及脉络膜血流进行定量分析，使眼科学者在新旧疾病的认识上有了新的突破，将疾病进行了更加细致划分。虽然OCTA已被证实在小鼠脉络膜照射激光斑后的早期时段能明显识别新生血管［13］，但FFA和OCTA两种诊断技术在识别小鼠CNV模型中的优劣仍未可知。
本研究采集了小鼠CNV模型中激光造模后第7天、第14天的激光斑图片及面积，通过对比发现造模后第14天激光斑面积较第7天减小；表明在激光造模后的第14天，CNV形成稳定并排除了激光焦化作用产生的对观察结果的影响。基于此，本研究采用小鼠CNV模型激光造模后第14天的不同影像学检查结果与同期的脉络膜铺片结果进行对比及分析。本研究中以脉络膜铺片作为金标准，比较OCTA、激光眼底照相以及FFA 3种技术描述小鼠CNV模型的一致性，结果发现：对于激光斑的形态，OCTA以及FFA均能准确显示激光斑形态；通过一致性分析发现，FFA早期荧光形态与脉络膜铺片的一致性最好(rICC=0.488，P=0.003)，其次为眼底彩照(rICC=0.382，P=0.019)以及FFA晚期(rICC=0.330,P=0.037)；而OCTA与脉络膜铺片的一致性最差(rICC=-0.106,P=0.700)。本研究结果显示，OCTA与FFA相似，均可描述CNV病灶的面积，并且均显示出造模后第14天CNV面积小于造模后第7天，两种技术作为CNV的定性诊断趋势一致。但OCTA作为描述激光斑面积的定量诊断方法，与脉络膜铺片的一致性较FFA差，对于小鼠CNV模型激光斑的诊断手段，FFA似乎更加可靠。因此，FFA依旧是描述小鼠CNV模型中激光斑的最佳技术，仍不可忽略和取代。
本研究也有一定局限性，本研究只是针对激光制作的小鼠CNV模型进行研究，并未探索在人类眼科疾病中是否有相同的结果。本研究应用荧光素钠进行对比试验，而应用非吲哚菁绿行脉络膜造影，是考虑FFA的应用范围较广，具有更大应用价值。下一步我们将会观察多种视网膜疾病的表现，探讨其他疾病是否有相同的结果。