《眼科新进展》 2021年7期
621-627
出版日期：2021-07-05
ISSN:1003-5141
CN:41-1105/R
高糖环境下lncRNA MEG3对人视网膜血管内皮细胞增殖和迁移的作用及其机制
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病性微血管病变中最严重的并发症之一，已成为当前全球重要的致盲眼病。目前，除了玻璃体内注射抗VEGF药物以及视网膜光凝外，临床上尚缺乏其他有效的控制 DR 发生发展的治疗方法［1-3］。长期高血糖引起的眼部微环境失衡（高糖、缺氧等因素）能够诱发关键基因，如VEGF通路相关基因，在表达水平和表观遗传学上出现异常，这是DR 病情进一步发展的重要原因［4］。因此，观察DR发展过程中关键基因表达水平的变化对深入探索DR的发病机制及其精准治疗均具有重要的意义。长链非编码RNA（lncRNA）是哺乳动物体内常见的非编码RNA，能够通过特异性碱基配对及结合，调控前体mRNA剪接、mRNA翻译以及miRNA的功能，在肿瘤发展以及心血管病变等疾病中均有报道［5］。lncRNA广泛存在于哺乳动物组织器官中，可通过微小RNA（miRNA) 应答元件（MRE）作为miRNA（另一类 22 nt 左右的非编码 RNA）的吸附物而发挥功能［6-8］。lncRNA 在眼部疾病已有报道，如青光眼、视网膜母细胞瘤等［9-10］。有报道表明lncRNA MEG3/mir223/NLRP3炎症小体信号轴可促进内皮细胞凋亡［11］。在DR发病中，lncRNA MEG3可通过 PI3k/Akt信号通路调控视网膜内皮细胞的功能［10］。然而lncRNA MEG3的具体作用机制尚未完全明确。
本研究团队曾利用miRNA 芯片和qRT-PCR进行研究发现，miR-223-3p 在 DR患者的血清和房水中水平均有升高，并通过调控下游FBXW7靶基因抑制DR新生血管生成［12］，通过进一步的生物信息学预测发现，lncRNA MEG3与mir-223-3p可能存在相互作用。因此，本研究旨在探讨lncRNA MEG3在高糖环境下对人视网膜血管内皮细胞（hRECs)增殖和迁移的作用及其机制，为DR的发病机制、临床预防和治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 主要材料 hRECs购自中科院上海细胞库，Hek293细胞(人胚肾293细胞；实验室自存)，胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)，DMEM培养基(美国Hyelone公司)，2.5 g·L-1胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(凯基生物科技发展有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)(美国Amresco公司)，FBXW7抗体(英国Abcam公司)。SuperRT cDNA Kit、2×Taq Master Mix及染料(北京康为世纪生物科技有限公司)，伤口愈合插件（德国Ibidi公司），ECL化学发光法显色试剂盒（北京索莱宝公司）。siRNA序列由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，lncRNA引物由吉玛生物(苏州)股份有限公司设计合成。双荧光素酶报告基因和lncRNA MEG3结合位点或野生型/突变型基因质粒及过表达质粒、miR-223-3p mimics均从上海吉凯基因化学技术有限公司订购。
1.2 方法
1.2.1 hRECs的培养 hRECs接种于96孔板，细胞密度为30个·μL-1，置于含体积分数10% FBS、20 g·L-1青-链霉素溶液双抗的DMEM培养基，在37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养。将hRECs分为正常（低糖）组、高糖（对照）组、lncRNA MEG3过表达（高糖）组、lncRNA MEG3过表达对照（高糖）组、lncRNA MEG3沉默（高糖）组、lncRNA MEG3沉默对照（高糖）组、lncRNA MEG3过表达+沉默（高糖）组及lncRNA MEG3+miR-223-3p过表达组。正常（低糖）组在培养基中加入5.5 mmol·L-1葡萄糖，所有高糖组在培养基中加入25.0 mmol·L-1葡萄糖。
1.2.2 lncRNA MEG3对hRECs增殖的影响 各组hRECs接种于96孔板，细胞密度为30个·μL-1，培养24 h贴壁后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养箱内培养1 h，于酶标仪450 nm下测各孔光密度（D）。设置足够多的平行培养孔，连续6 d检测各组hRECs增殖情况。
1.2.3 lncRNA MEG3对hRECs愈合能力的影响 将上述各组hRECs接种于培养皿，细胞密度为30个· μL-1，培养至融合度达到90%左右后，用移液枪头对细胞表面进行划痕。使用光学显微镜观察并分别在划痕后0 h、24 h 照相，使用IncuCyte ZOOM软件扫描图像并计算各组hRECs划痕相对细胞密度（RWD）。
1.2.4 lncRNA MEG3对hRECs迁移能力的影响 各组hRECs置入孔径为8.0 μm的Transwell小室，小室内加入200 μL 含10×103个hRECs的无FBS培养基培养48 h。吸弃上下室培养基，用棉签擦净上室内细胞，24孔板内加入40 g·L-1多聚甲醛室温下固定30 min，吸弃多聚甲醛，PBS冲洗小室背面2遍，24孔板内加入结晶紫600 μL，室温下染色20 min，吸出后PBS冲洗小室背面2遍，光学显微镜下观察上室并照相，任意取5个视野进行hRECs计数。
1.2.5 细胞转染将lncRNA MEG3、抑制剂及miR-223-3p导入hRECs 各组hRECs覆盖培养皿底部 70%左右时，吸弃完全培养基，PBS清洗 2~3 次。六孔板每孔 250 μL无血清培养基 Opti-MEM和5 μL lipo2000 配制成混合液，静置 5 min，然后再用适量的质粒和 250 μL Opti-MEM 配制成质粒混合液，静置 20 min，lipo2000 和 Opti-MEM 的混合液加入到质粒混合液中混合均匀。 在六孔板每孔加入 1.5 mL Opti-MEM 然后再加入上面配置好的混合液，放入培养箱中培养 4~6 h。
1.2.6 双荧光素酶报告基因实验观察lncRNA MEG3与miR-223-3p的相互作用 RegRNA在线服务器“http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw”以及miRcode “http://www.mircode.org/” 在线服务器被用于预测能够与lncRNA MEG3直接相互作用的miRNA，其中，miR-223-3p被预测为lncRNA MEG3的直接靶点。Hek293细胞接种于24 孔板进行培养，待细胞贴壁后将细胞分为lncRNA MEG3野生型对照组、lncRNA MEG3野生型+miR-223 mimic组、lncRNA MEG3突变型对照组、lncRNA MEG3突变型（Site 1）+miR-223 mimic组、lncRNA MEG3突变型（Site 2）+miR-223 mimic组和lncRNA MEG3突变型（Site 1+Site 2）+miR-223 mimic组。使用lipo2000完成上述质粒与miR-223 mimic对Hek293细胞的共转染，步骤同1.2.5。报告质粒构建时，lncRNA MEG3插入萤火虫荧光素酶的3’ UTR区域，而携带海肾荧光素酶基因的质粒则共同转染作为内参。Hek293细胞转染后培养24 h，加入100 μL裂解液裂解细胞15 min。采用双荧光素酶分析系统进行检测，在40 μL 荧光素酶检测试剂 II中加入10 μL细胞裂解液，吹打混匀后，检测萤火虫荧光素酶的活性（D560 nm），随后加入40 μL荧光淬灭试剂，再次读数，即为海肾荧光素酶的活性（D465 nm）。计算每组的萤光虫荧光素酶/海肾荧光素酶的信号比值，对照组比值为100%。
1.2.7 qRT-PCR检测高糖及低糖环境下hRECs中lncRNA MEG3表达水平 采用RNA试剂盒 Takara提取总RNA。利用Taqman miRNA ABC纯化试剂盒提取总RNA，用逆转录酶扩增lncRNA MEG3的cDNA，SYBRgreen实时定量PCR混合物测定lncRNA MEG3在hRECs中的表达，GAPDH作为内参。lncRNA MEG3引物序列：上游引物为5’-AGCGCTTCTGAAGACCAAAC-3’、下游引物为5’-GAACACAAAGACACCCAGCA-3’，大小为20 bp。利用2-ΔΔCt计算hRECs中lncRNA MEG3 mRNA的相对表达水平。
1.2.8 实时荧光定量PCR检测高糖环境下PABPC1过表达或沉默对hRECs中lncRNA MEG3的表达水平的影响 pcDNA3.1(+)-PABPC1 过表达质粒以及siPABPC1 沉默RNA由上海吉玛制药技术有限公司合成。在高糖培养基内培养hRECs至培养皿底部细胞覆盖率为60%~70%时，采用Lipo2000试剂盒 (Life Technologies, 美国) 将过表达对照（1 g·L-1）、PABPC1过表达质粒（1 g·L-1）、PABPC1沉默RNA（40 nmol·L-1）以及沉默对照（40 nmol·L-1）转染入hRECs。继续培养48 h后收集细胞，并提取总RNA，采用qRT-PCR方法测定lncRNA MEG3在hRECs内的表达水平（方法同1.2.7）。
1.2.9 Western blot检测lncRNA MEG3对FBXW7蛋白表达水平的影响 待各组hRECs覆盖培养皿底部大约70%左右的时候，吸弃培养皿中的完全培养基，用 PBS 清洗 2~3 次。RIPA 裂解液与蛋白酶抑制剂按体积比100∶1 混合后，每孔加入适量的混合液，放置在冰上 5 min充分裂解。细胞放置在离心管中并在冰上静置 20 min，在 4 ℃下13 000 r·min-1 离心 15 min，取上清。上清蛋白经过SDS-PAGE电泳后，将蛋白条带电转至PVDF膜，使用50 g·L-1脱脂奶粉封闭，分别使用兔抗人FBXW7一抗、鼠抗兔二抗完成孵育与洗涤，使用ECL 化学发光法显色试剂盒进行显色。显色后，条带使用Gelpro软件扫描黑度计算相对含量，以各样品对应的GAPDH相对含量为基准。
1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行分析。高糖组与正常（低糖）组hRECs中lncRNA MEG3相对表达水平差异比较采用单因素方差分析；不同试剂或质粒转染组间细胞移行数、RWD、细胞中FBXW7蛋白相对表达量、lncRNA-MEG3荧光素酶活性和细胞中lncRNA MEG3相对表达水平差异比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 不同环境下hRECs中lncRNA MEG3的表达水平 以正常（低糖）组hRECs中lncRNA MEG3表达量（1.00±0.09）为基准，高糖（对照）组hRECs中lncRNA MEG3的表达量（0.49±0.05）较正常（低糖）组下降，差异有统计学意义（F=73.613，P=0.001）。
2.2 各组hRECs增殖率比较 CCK-8法检测结果显示，hRECs连续培养5 d，高糖（对照）组与正常（低糖）组相比，hRECs增殖能力显著上升（F=328.044，P<0.001）;lncRNA MEG3过表达（高糖）组 hRECs增殖能力显著低于lncRNA MEG3过表达对照（高糖）组（F=121.193，P＜0.001）；lncRNA MEG3 沉默（高糖）组hRECs增殖能力稍高于lncRNA MEG3沉默对照（高糖）组，但差异不显著（F= 0.689，P=0.453）（见表1）。
2.3 过表达或沉默lncRNA MEG3对hRECs愈合及迁移能力的影响 细胞划痕实验结果发现，高糖（对照）组hRECs［RWD（98.2±9.6）%］愈合速度显著高于正常（低糖）组［RWD(30.5±4.5）%］（F=85.735，P=0.005）;lncRNA MEG3过表达（高糖）组hRECs［RWD(33.6±4.3）%］愈合速度显著低于lncRNA MEG3过表达对照（高糖）组［RWD(30.5±4.5）%］（F=121.193，P＜0.001）；而lncRNA MEG3沉默（高糖）组hRECs［RWD(99.7±9.2）%］愈合速度略高于lncRNA MEG3沉默对照（高糖）组［RWD(93.6±8.8）%］，但两者差异不显著（F=0.689,P=0.453）（图1A）。
Transwell实验结果发现，高糖（对照）组hRECs［细胞迁移数(377±22）个］迁移速度显著高于正常（低糖）组［细胞迁移数（322±24）个］（F=89.240，P=0.008）；lncRNA MEG3过表达（高糖）组hRECs［细胞迁移数（209±18）个］迁移能力显著低于lncRNA MEG3过表达对照（高糖）组［细胞迁移数（319±36）个］（F=22.407，P=0.009）；而lncRNA MEG3沉默（高糖）组hRECs［细胞迁移数(497±51）个］迁移能力显著高于lncRNA MEG3沉默对照（高糖）组［细胞迁移数(352±33）个］（F=17.093，P=0.014）（图1B）。
2.4 双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA MEG3与miR-223-3p的直接作用 经预测，lncRNA MEG3具有与miR-223-3p直接配对的两个潜在靶点（见图2）。lncRNA MEG3与miR-223-3p的潜在直接作用位点位于MEG3序列的301-324位（位点1）以及498-518位（位点2）。
双荧光素酶报告基因实验检测发现，添加miR-223-3p后野生型 lncRNA MEG3的荧光素酶活性由(100.0±8.3)%降至(51.5±6.2)%（F=66.691, P=0.001），突变型 lncRNA MEG3的荧光素酶活性由(98.8±6.8)%降至(61.5±5.1)%（位点1，F=58.657,P=0.002）和(70.3±6.2)%（位点2，F=29.104，P=0.006）。而在lncRNA MEG3的双位点（位点1+位点2）突变中，荧光素酶活性由(98.8±6.8)%降至(97.8±8.3)%，差异不显著（F=0.049，P=0.836）。该结果验证了lncRNA MEG3的位点1和位点2都能够和miR-223-3p发生直接的相互作用。
2.5 miR-223-3p mimic 逆转过表达lncRNA MEG3对hRECs增殖的抑制作用 当同时转染过表达lncRNA MEG3质粒和miR-223-3p后，可恢复高糖的细胞表型（见表2）。lncRNA MEG3过表达可显著抑制hRECs增殖，而共转染miR-223-3p mimic后，lncRNA MEG3过表达对hRECs增殖的抑制作用被逆转了。
2.6 miR-223-3p mimic 逆转了过表达lncRNA MEG3对hRECs细胞愈合以及迁移能力的抑制作用 愈合实验结果发现，高糖（对照）组hRECs愈合能力［RWD（85.5±7.3）%］与lncRNA MEG3过表达对照（高糖）组［RWD（86.3±8.2）%］差异无统计学意义（F=0.145，P=1.553）；lncRNA MEG3过表达（高糖）组hRECs愈合能力［RWD(28.9±3.6）%］显著低于lncRNA MEG3过表达对照（高糖）组（RWD(86.3±8.2）%］（F=89.732，P=0.002）和lncRNA MEG3 +miR-223-3p过表达（高糖）组［RWD(87.6±9.0）%］（F=110.016，P＜0.001）及lncRNA MEG3过表达+沉默（高糖）组［RWD(89.5±7.5）%］（F= 97.332，P=0.001）（图3A）。
Transwell实验结果显示，高糖（对照）组hRECs迁移数［（385±41）个］与lncRNA MEG3过表达对照（高糖）组［细胞迁移数（352±37）个］差异无统计学意义（F=0.357，P=0.972）；lncRNA MEG3过表达（高糖）组hRECs迁移数［（187±22）个］显著低于lncRNA MEG3过表达对照（高糖）组［细胞迁移数（352±37）个］（F=35.725，P=0.003）； lncRNA MEG3过表达（高糖）组hRECs迁移数显著低于lncRNA MEG3 +miR-223-3p过表达（高糖）组［细胞迁移数（322±34）个］（F=33.338，P=0.004）；而lncRNA MEG3过表达（高糖）组hRECs迁移数显著低于lncRNA MEG3过表达+沉默（高糖）组［细胞迁移数（309±28）个］（F= 30.457，P=0.007）（图3B）。结果表明，lncRNA-MEG3可通过调控 miR-223-3p进一步影响hRECs的愈合和迁移能力。
2.7 lncRNA过表达对miR-223-3p下游靶点FBXW7的影响 Western blot检测结果显示，正常（低糖）组hRECs中FBXW7蛋白相对表达量显著高于高糖（对照）组（F=195.226，P＜0.001）; lncRNA MEG3过表达（高糖）组hRECs中FBXW7蛋白相对表达量显著高于lncRNA MEG3过表达对照（高糖）组（F=185.443, P＜0.001），而lncRNA MEG3+miR-223-3p过表达（高糖）组或lncRNA MEG3过表达+沉默（高糖）组中，这一趋势得以逆转（F=162.257，P＜0.001；F=145.293，P＜0.001）（图4）。这表明lncRNA MEG3为miR-223-3p的上游基因，可调控mir-223-3p的下游靶点并发挥作用；lncRNA MEG3、miR-223-3p以及FBXW7处于同一信号通路内。
2.8 PABPC1对hRECs中lncRNA MEG3相对表达水平的影响 高糖条件下，hRECs中lncRNA MEG3的表达水平（1.00±0.05）为基准；相对于lncRNA MEG3过表达对照组（0.98±0.04），PABPC1基因的过表达则显著提升了hRECs中lncRNA MEG3的相对表达水平（1.64±0.13）（F=70.638，P=0.001）；相对于lncRNA MEG3沉默对照（1.02±0.07），PABPC1基因的沉默则显著降低了hRECs中lncRNA MEG3的相对表达水平（0.49±0.03）（F=145.293，P＜0.001）。这说明PABPC1可能是lncRNA MEG3的上游调控元件。
3 讨论
DR作为高致盲眼病之一，临床上尚无有效的根治方法。因此，全面了解 DR的潜在发病机制可为临床医师有效防治DR提供新的理论依据［13］。课题组曾研究发现,DR发病中，miR-223-3p的表达上调是导致细胞增殖的重要因素［12］。近年来，lncRNA被确定为新的转录和表观遗传网络的调节因子［14-15］，lncRNA可以像分子“海绵”一样吸附下游miRNA而调节生物学功能［8-9］。即lncRNA可以竞争性地结合miRNA发挥作用。现有研究表明，lncRNA与一些眼部疾病及血管生成相关［10, 16］。在DR进展过程中，lncRNA-RNCR2、NEAT2、CDKN2B-AS1和PVT1均有显著变化［9］ ; lncRNA MALAT1通过调节 miR-125b/ve-cadherin 信号轴促进DR新生血管的生成。
本研究中，我们利用RegRNA以及miRcode等在线生物信息学预测工具预测了lncRNA MEG3和miR-223-3p存在两个潜在的结合位点，并进一步采用双荧光素酶基因报告实验进行验证，结果显示，miR-223-3p能够抑制带有野生型lncRNA MEG3序列质粒的荧光素酶活性，这说明两者是有直接结合的；而突变位点1后，荧光素酶活性显著下降，但下降幅度低于野生型，突变位点2后，荧光素酶活性下降幅度继续降低。这说明，预测的两个位点在lncRNA MEG3与miR-223-3p的结合中起重要作用，而突变位点2发挥了主要的作用。在高糖培养环境中，hREC中lncRNA MEG3表达显著低于正常低糖环境，这说明lncRNA MEG3在DR的相关生理环境中可能是受到抑制的。根据前期报道，在人主动脉内皮细胞内miR-223-3p 水平与lncRNA MEG3有一定的关系［11］，而在本研究中，在高糖环境中lncRNA MEG3 过表达可以抑制hRECs的增殖能力、愈合能力以及迁移能力，但这种影响趋势能够被共转染的miR-223-3p或沉默lncRNA MEG3逆转，这说明miR-223-3p极有可能是lncRNA MEG3的直接下游靶点。此外，在前期研究中，miR-223-3p 的3’ UTR 区域被证明可以与FBXW7直接相互作用，并进一步影响 notch1通路［12,17］。因此，本研究观察了高糖环境中lncRNA MEG3过表达对FBXW7的影响，结果显示：过表达lncRNA MEG3能够显著提升hRECs中FBXW7蛋白表达水平，而共转染miR-223-3p或lncRNA MEG3后，该趋势被逆转。这进一步证实了高糖环境下lncRNA MEG3、miR-223-3p与FBXW7处于同一信号通路内。
根据前期报道，PABPC1是一种核酸结合蛋白，通过结合 RNA分子的 poly (a)尾部，参与调节途径和稳定lncRNA［18-20］。为了探索lncRNA MEG3的上游作用元件并解析高糖环境中lncRNA MEG3水平降低的分子机制，本研究利用调控PABPC1的水平来干预lncRNA MEG3,结果显示，高糖环境中，过表达PABPC1可以显著提升lncRNA MEG3在hRECs中的相对表达水平；而沉默PABPC1基因后，lncRNA MEG3相对表达水平也显著降低。这说明PABPC1极有可能是lncRNA MEG3的上游调控元件。
综上，本研究围绕hRECs展开体外细胞水平的工作，在模拟DR的高糖环境下，lncRNA MEG3被证实为miR-223-3p分子的直接上游调控元件，并通过miR-223-3p对hRECs的增殖、愈合以及迁移能力等进行抑制，同时也初步验证了lncRNA MEG3的上游调控元件可能为PABPC1。