《眼科新进展》  2021年6期 506-510   出版日期：2021-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
龙胆泻肝汤抑制Notch信号通路活化对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠Th1、Th2细胞分化的影响


葡萄膜炎是一类临床常见、严重威胁患者视力的发生于虹膜、睫状体和脉络膜的炎症性眼病。据报道，全球有 5%~10%的视力受损是由葡萄膜炎导致的，其中高达35%葡萄膜炎患者视功能严重受损甚至失明［1］。有研究发现，Th1/Th2细胞比例失衡与葡萄膜炎发病有关，其中Th1细胞是自身免疫性葡萄膜炎的主要致炎细胞群，Th2细胞可分泌炎症保护类因子从而促进葡萄膜炎的恢复［2-3］。Notch 信号通路可通过调控Th1和Th2细胞的分化影响两者的比例平衡，从而调节炎症反应，在自身免疫性疾病中发挥重要作用［4-5］。
龙胆泻肝汤（LXD）是一种传统的中医汤药，对肝胆火炽型葡萄膜炎等免疫性眼病具有良好的治疗作用。LXD可通过多种途径在实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）治疗过程中发挥免疫调节作用。我们前期研究发现，LXD通过抑制干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-17（IL-17）相关炎症因子的表达促进IL-10的表达,发挥其抗炎作用［6］。此外，LXD还可显著降低EAU大鼠脾脏和淋巴结中 Notch1、Notch2、Notch4基因和蛋白的表达水平，显著改善 Th17/Treg 细胞比例失衡，从而促进机体自身免疫炎症的恢复［7-8］。但是LXD是否通过抑制Notch信号通路活化来调节Th1/Th2细胞分化，使两者比例达到平衡从而达到治疗葡萄膜炎的目的尚不清楚。Rbpj作为Notch信号通路的一种重要的转录因子,在Notch信号通路的活化中发挥重要作用。本研究通过探讨LXD对Notch信号通路的转录调节因子Rbpj的调控作用，阐释LXD对EAU大鼠Th1、Th2细胞分化的影响，为临床治疗葡萄膜炎提供新的理论依据。
1　材料与方法　
1.1　实验动物及处理　选用由北京维通利华实验动物技术有限公司提供的6～8周龄雌性Lewis大鼠（160～180 g)30只为实验对象。实验前动物首先进行为期1周的环境适应，并进行常规检查以排除眼部或全身疾病动物。实验动物在室温(25±1)°C、相对湿度为50%±10%、12 h光照和12 h黑暗交替循环条件下饲养。实验动物的处理原则严格遵守国家卫生研究院颁布的《实验动物护理和使用指南》。本实验经山东中医药大学眼科研究所伦理委员会批准。
1.2　主要试剂及仪器　LXD配方颗粒(华润三九医药股份有限公司，深圳)；FITC-CD4（博奥森生物技术有限公司，北京）； PE-IFN-γ、PE-IL-4 (eBioscience,美国）；Ficoll淋巴细胞分离液(Solarbio公司，北京）；RNA组织/细胞快速提取试剂盒(思科捷公司，济南）；cDNA逆转录试剂盒、2×SYBR Green I试剂盒(南京诺维赞公司,南京)；BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司，上海）；大鼠EILSA（Rbpj、IFN-γ和IL-4）试剂盒（上海江莱生物技术有限公司，上海)。LightCycler 480实时荧光定量PCR（Q-PCR)仪（Roche公司，美国）；多功能酶标仪（Perkin-Elmer公司，美国）；荧光分光光度计（F3000，日立公司，日本）；流式细胞仪（BD FACSVerseTM，美国）。
1.3　实验动物分组及处理　用随机数字表法将大鼠分为正常对照组（10只）、EAU模型组（10只）和LXD干预组（10只），参照文献［9］方法建立EAU大鼠模型，即在EAU模型组和LXD干预组每只大鼠后肢足垫、两侧腹壁及躯干上皮下注射200 μL含有光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）、结核分枝杆菌(TB)H37RA、完全弗氏佐剂（CFA）和无菌磷酸盐缓冲液(PBS)的乳糜液来诱导EAU，正常对照组大鼠注射等量只含TB和CFA的乳糜液。LXD干预组大鼠造模后每天给予1000 mg·kg-1LXD灌胃处理(大鼠LXD使用剂量为临床等效剂量折算的5倍)，EAU模型组和正常对照组大鼠给予等量生理盐水灌胃，均为每天1次。各组大鼠不同处理条件干预后12 d，使用50 g·L-1 苯巴比妥溶液按 50 mg·kg-1剂量腹腔注射处死大鼠，用于以下实验。
1.4　Q-PCR检测各组大鼠不同组织中Rbpj基因表达　干预后12 d，三组大鼠每组随机各取3只处死，无菌条件下分离脾脏、淋巴结和眼组织。按照RNA组织/细胞快速提取试剂盒说明书从组织中提取总RNA,用K5600分光光分度计检测RNA的纯度和浓度 (A260/A280为1.8~2.1) 。将提取的总RNA用cDNA逆转录试剂盒反转录为cDNA，然后进行Q-PCR检测 (反应体系为20 μL,每个基因设3个复孔)，将GAPDH设为内参。引物序列分别为：GAPDH上游引物为5’- CACGGCAAGTTCAACGGCACAGT -3’,下游引物为5’- AGCGGAAGGGGCGGAGATGAT -3’，产物长度为222 bp；Rbpj上游引物为5’-TGTCCT TGCCCCGGTCACTCCT-3’,下游引物为5’-TCGGCCTCTACATCCCCAAACCAC-3’，产物长度为138 bp。Q-PCR反应条件设置为：95 ℃、5 min，反应循环1次；95 ℃、20 s，57 ℃、25 s，60 ℃、25 s，循环45次。Q-PCR检测结束后,按照 2-ΔΔCt计算Rbpj的基因表达情况,并进行数据统计分析。实验重复3次。
1.5　ELISA检测各组大鼠不同组织Rbpj、IFN-γ和IL-4蛋白表达水平　干预后12 d，三组大鼠每组随机各取3只处死，分别收集各组大鼠的脾脏、淋巴结以及眼组织，在液氮中充分研磨至细粉状，然后加入350 μL RIPA裂解液溶解后电动匀浆30 s，将样品置于冰上,超声波细胞粉碎机超声20 min,8000 r·min-1离心10 min，收集上清液。BCA法测定各组样品蛋白浓度，ELISA试剂盒检测Rbpj、IFN-γ和IL-4蛋白的表达水平。实验重复3次。
1.6　流式细胞仪检测各组大鼠不同组织Th1、Th2水平　干预后12 d，三组大鼠每组各取4只处死，将各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织分别研磨后过滤，尼龙毛富集T淋巴细胞，然后用大鼠淋巴细胞分离液进一步纯化得到的T淋巴细胞。加入 4 μL细胞刺激混合剂（包含cocktail刺激液和Golgistop蛋白转运抑制剂），振荡器涡旋10 s充分混匀。置于37 ℃、含体积分数5%的CO2培养箱中避光孵育5 h；孵育后用FITC-CD4行细胞表面染色，然后用破膜溶液对细胞固定破膜后分别用PE-IL-4和PE-IFN-γ进行细胞内染色，振荡器涡旋10 s充分混匀。染色结束后加入400 μL PBS重悬细胞，滤网过滤,流式细胞仪检测各组大鼠不同组织中Th1、Th2细胞表达水平,分析Th1/Th2细胞比例。实验重复3次。
1.7　统计学分析　用GraphPad Prism 8、SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料均以x?±s表示,使用Levene检验方差齐性。统计学差异比较均采用单因素方差分析,各组间两两比较采用LSD检验。检验水准:α=0.05。
2　结果　
2.1　各组大鼠不同组织中Rbpj mRNA的相对表达水平　Q-PCR检测结果显示，干预后12 d，与正常对照组大鼠相比，EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Rbpj mRNA相对表达水平均显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.001)；与EAU模型组相比，LXD干预组大鼠各组织中Rbpj mRNA相对表达水平均显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.01)（见表1）。



2.2　各组大鼠不同组织中Rbpj、IFN-γ和IL-4蛋白的表达水平　ELISA检测结果显示，干预后12 d，与正常对照组大鼠相比，EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Rbpj和IFN-γ蛋白的表达水平均显著升高，IL-4蛋白的表达水平均显著降低(均为P<0.05)；与EAU模型组相比，LXD干预组大鼠各组织中Rbpj和IFN-γ蛋白表达水平均明显降低，IL-4蛋白表达水平均明显升高 (均为P<0.05) （见表2）。



2.3　Th1、Th2细胞的表达水平以及其比例变化　流式细胞仪检测结果显示，干预后12 d,与正常对照组大鼠相比，EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Th1细胞水平均明显升高，Th2细胞水平均明显下降，Th1/Th2细胞比例均呈不平衡状态(均为 P<0.05)；相比于EAU模型组，LXD干预组各组织中Th1细胞水平均明显降低，Th2细胞水平均显著升高，Th1/Th2比例逐渐恢复平衡(均为P<0.01) （见图1-2，表3）。







3　讨论
Notch信号通路是调节炎症反应和自身免疫性疾病的重要信号通路，可通过调控 nave CD4+ T 细胞的分化水平影响Th细胞的比例平衡发挥作用［10］。前期有研究已证实，EAU大鼠Th17/Treg细胞比例失衡与葡萄膜炎病程发展密切相关［11］；Notch 信号通路的活化可调节Th17和Treg细胞分化，破坏CD4+/CD8+和Th17/Treg平衡，加重EAU 的发病程度，EAU大鼠CD4+/CD8+和Th17/Treg的动态变化与Notch 信号的表达趋势及 EAU 病情发展趋势一致［12］。另有研究表明，葡萄膜炎的发生发展与Th1/Th2细胞比例以及相关细胞因子表达失衡有关［13-19］。在EAU的发生发展过程中,Th1主要表现为促进疾病进展,而Th2则主要表现为对疾病的负调控［15］。Th1细胞以分泌IFN-γ为主要特征,主要负责细胞免疫、诱导迟发型超敏反应，而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，其中IL-4分泌最具有代表性,主要参与IgG1和IgE抗体产生。IFN-γ和IL-4可以分别代表Th1和Th2细胞应答的水平［16］。调整Th1/Th2细胞因子平衡网络是治疗自身免疫性疾病的一种新方法。现研究已证实，使用IFN-γ和IL-4作为靶点的基因治疗，可以显著抑制EAU的发生及严重程度［17］。Notch信号通路在多种自身免疫性疾病中可通过调控Th1、Th2细胞分化来影响机体生理状态［18-19］，但Notch通路是否通过调控Th1、Th2细胞的分化进而影响葡萄膜炎的发生发展尚不清楚。本研究结果表明，在EAU发生发展过程中，Rbpj作为重要转录因子,可在Notch信号通路的活化中发挥重要作用。Notch信号通路的活化在Th1和Th2细胞分化过程中起重要作用，与葡萄膜炎的发病进程密切相关。
LXD对葡萄膜炎等免疫性眼病具有良好的治疗作用。有研究发现，龙胆泻肝胶囊可下调葡萄膜炎患者外周血中TNF-α、IFN-γ、IL-23 的表达水平，促进机体免疫状态的改善［20］。进一步研究发现，LXD能有效降低 EAU 大鼠CD4+/CD8+的比例，抑制脾脏、淋巴结和眼组织中 Notch 信号通路活化和 Th17 细胞分化，显著提高 IL-10 的表达水平，改善 Th17/Treg 细胞比例，从而调节EAU大鼠全身的免疫状态，减轻眼部炎症反应，保护眼部组织结构［8，21-22］。
缩进补体与多种自身免疫性疾病有关，在免疫稳态调节方面发挥重要作用。有研究证实，LXD可通过降低EAU大鼠血清补体C4表达水平，提高MBL2表达水平，促进系统恢复平衡，加快炎症消退［23］。临床和基础研究均证实，LXD通过抑制葡萄膜炎大鼠Notch信号通路，可显著减少葡萄膜炎大鼠的炎症细胞浸润，降低相关炎症细胞因子的表达水平，调节全身补体系统，改善Th17/Treg细胞比例，恢复机体的免疫平衡，从而达到治疗葡萄膜炎的目的。本研究结果发现，相比于正常对照组，干预后12 d的EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Rbpj基因及蛋白表达水平均明显升高，Th1/Th2细胞比例均显著升高；与EAU模型组相比，LXD干预组大鼠各组织中Rbpj 基因及蛋白表达水平均明显降低，Th1/Th2细胞比例逐渐恢复均衡，提示LXD可通过抑制Notch信号通路的活化调节Th1、Th2细胞的分化来影响其比例平衡，从而发挥治疗葡萄膜炎的作用。
缩进Notch信号通路的活化可导致EAU大鼠Th1/Th2细胞比例的失衡。LXD可通过下调EAU大鼠转录因子Rbpj的表达抑制Notch信号通路的活化，明显降低Th1细胞以及IFN-γ表达水平，提高Th2细胞以及IL-4表达水平，改善EAU大鼠Th1/Th2细胞比例，达到治疗葡萄膜炎的目的。本研究为临床应用LXD治疗葡萄膜炎提供了新的干预靶点和理论依据，但其调控Th1/Th2细胞分化的详细机制还需进一步研究。