《眼科新进展》  2021年4期 306-310   出版日期：2021-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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紫外线B照射在抑制人视网膜色素上皮细胞自噬中的作用


年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致视力不可逆丧失的主要原因之一^［1-2］，其病因是多因素的，其中包括阳光照射^［3］。阳光中紫外线B(ultraviolet，UVB)是皮肤癌和眼部疾病的主要病因，如AMD^［4-5］。在视网膜中，视网膜色素上皮(RPE)细胞在维持内环境稳定中起着至关重要的作用，是视觉的重要调节因子^［6］。RPE细胞的死亡和功能障碍与AMD的发病密切相关，AMD的早期和关键事件使RPE细胞变性和损害^［7］，继而导致感光细胞死亡、视力丧失。
????????导致AMD发生的许多病理因素需要RPE细胞中细胞自噬-溶酶体途径（autophagy lysosome pathway,ALP)和泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system，UPS）降解和循环^［8］，因此，这两个系统在维持细胞内环境稳定中有重要作用。越来越多的研究表明，RPE细胞自噬能力的损害与AMD的发生密切相关^［9-10］。然而UVB是否通过改变RPE细胞自噬导致AMD的发生发展仍然未知。本研究拟用人RPE细胞株ARPE-19细胞进行UVB照射，检测UVB对细胞生长及其自噬的影响。
1　材料与方法
1.1　材料ARPE-19细胞株来自美国菌种保存中心（ATCC）。紫外线剂量计购自Daavlin 公司(美国)。细胞生长测定试剂盒CDG1、雷帕霉素（rapamycin，RAPA）、 环氧霉素（epoxomicin， EPO）、青霉素和链霉素、氯化铵（NH₄Cl）购自Sigma公司(美国)。抗Beclin-1、抗LC3、抗p62、抗β-actin和抗山羊-HRP购自Santa Cruz Biotechnology(美国)。抗兔-HRP和抗鼠-HRP等二抗购自GE公司(美国)。DMEM和胎牛血清购自Gibco公司(美国)。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养与UVB照射ARPE-19细胞在添加体积分数10%胎牛血清、100 U·mL^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素的DMEM中保存。细胞在37 ℃、体积分数5% CO₂条件下加湿培养。细胞用PBS洗2次后，加入PBS覆盖，用UVB照射仪(Joland,美国) 进行不同剂量UVB照射（UVB照射组），用IL1400A 放射计联合UVB探测仪（美国国际光学公司）检测UVB输出剂量。照射后细胞置于新鲜培养基中继续培养，在不同时间点收集细胞，进行下一步实验。
1.2.2　UVB照射对细胞生存的影响采用MTT法测定细胞生存情况，将对数生长的ARPE-19细胞按每孔10⁴个铺于96孔板中，培养24 h后，PBS洗2次，每孔加入30 μL PBS，不同剂量（50 mJ·cm^-2、100 mJ·cm^-2和200 mJ·cm^-2）UVB照射， 未照射组作为对照组。照射后加入完全培养液，分别在照射后0 h、12 h、24 h、48 h收集细胞，MTT法检测细胞生存率。每孔加10 μL MTT 培养4 h,离心后弃掉上清，加100 μL DMSO，遮光振荡10 min。用多孔分光光密度计测定培养物的光密度，波长570 nm。结果以相对于对照组的百分比表示。
1.2.3　Western blot检测各组细胞中LC3和Beclin-1蛋白表达为了检测UVB照射是否导致细胞自噬的变化，采用Western blot检测标志细胞自噬激活的LC3和Beclin-1蛋白表达水平，并计算了LC3-I转换为LC3-II的比率（反映自噬流的主要指标）。培养于10 cm 培养皿中的ARPE-19 细胞用于Western blot 检测。采用UVB毒性实验中筛选出合适UVB剂量(100 mJ·cm^-2) 照射，并于合适时间(24 h)收集细胞，在照射后更换培养液时分别加入RAPA（50 nmol·L^-1）、NH₄Cl（20 mmol·L^-1）或者EPO(100 nmol·L^-1)。处理后的ARPE-19细胞用PBS洗2次，然后用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，用Bradford蛋白检测法检测蛋白浓度。用SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后转移到硝酸纤维素膜上。一抗孵育后，用连接HRP的二抗孵育，用增强化学发光试剂检测免疫反应蛋白。应用Image J 软件进行定量，并与对照组比较。
1.2.4　细胞自噬对于细胞生存的影响分析照射后分别加入完全培养液、含有RAPA（50 nmol·L^-1）的完全培养液或含NH₄Cl（20 mmol·L^-1）的完全培养液，分组如下：UVB照射组、RAPA组、UVB+RAPA组、NH₄Cl组、UVB+NH₄Cl组，MTT法检测同前。蛋白降解有两个主要通路^［11］:ALP和UPS，两者之间有交互作用。为了确定UVB对细胞自噬的作用是否受UPS变化的影响，应用EPO抑制UPS，应用RAPA作为细胞自噬增强剂，检测自噬蛋白的变化。
1.3　统计学分析每个实验重复三次，数据用均值±标准差表示。通过SPSS 18．0统计学软件采用student’s t-test方法进行分析， 检验水准：α=0.05。
2　结果
2.1　UVB照射对ARPE-19细胞生存的影响与对照组相比，UVB照射组ARPE-19细胞出现剂量依赖性生存下降（图1），50 mJ·cm^-2 UVB照射后细胞生存无明显改变；100 mJ·cm^-2和200 mJ·cm^-2 UVB照射后12 h细胞生存与对照组相比无明显改变；100 mJ·cm^-2UVB照射后24 h及48 h细胞生存率分别为(76.9±1.5)%和(80.3±2.0)%，与对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）；200 mJ·cm^-2 UVB照射后24 h及48 h细胞生存率分别为(47.5±1.9)%和(52.3±1.3)%，与对照组相比差异均有显著统计学意义（均为P<0.01）。与照射后24 h相比，100 mJ·cm^-2、200 mJ·cm^-2 UVB照射后48 h的细胞生存率均出现了一定程度的恢复，但差异均无统计学意义（均为P>0.05）。为便于后续研究，选择了引起细胞明显死亡并且细胞生存率大于50%的UVB照射剂量和时间点（100 mJ·cm^-2 UVB，24 h）收集细胞进行下面实验。



2.2　UVB照射抑制ARPE-19细胞中Beclin-1和LC3蛋白表达UVB照射组ARPE-19细胞照射后24 h，细胞出现LC3-II/LC3-I比率明显下降，与对照组相比差异有显著统计学意义（P<0.01）(图2A、2B)；UVB照射组ARPE-19细胞照射后24 h，细胞Beclin-1蛋白表达水平下降，与对照组相比差异有显著统计学意义（P<0.01） (图2A、2C)。



2.3　自噬增强剂逆转了UVB照射对自噬流的抑制作用应用RAPA为自噬增强剂，NH₄Cl为自噬溶酶体阻滞剂，检测自噬的增强或抑制能否逆转或增强UVB的作用。结果显示，在LC3蛋白的表达及LC3-II/LC3-I比率上，UVB+RAPA组与对照组、UVB照射组相比，差异均有显著统计学意义（均为P<0.01）(图3A、3B)，RAPA逆转了UVB照射降低LC3-II/LC3-I比率的作用；NH₄Cl则进一步增强了UVB照射的作用。对照组与其余各组细胞中LC3-II/LC3-I、Beclin-1蛋白表达水平差异均有统计学意义（均为P<0.05）(图3A、3C)；RAPA和NH₄Cl对于UVB照射抑制Beclin-1蛋白表达水平的作用均有一定程度的逆转，虽然未达到对照组水平，但UVB+RAPA组、UVB+NH₄Cl组与UVB照射组相比，显著增强了Beclin-1蛋白的表达（均为P<0.01）(图3A、3C)。



2.4　抑制UPS可以部分逆转UVB照射对于自噬启动的抑制与对照组相比，RAPA组细胞中LC3-II/LC3-I比率提高，Beclin-1蛋白表达水平降低（均为P<0.01)。与对照组相比，EPO组LC3-II/LC3-I比率提高，Beclin-1蛋白表达水平增加（P<0.01）；EPO并未逆转UVB照射引起的LC3-II/LC3-I比率的降低，UVB+EPO组未能使Beclin-1蛋白表达水平恢复到对照组水平（P<0.05），但UVB+EPO组与UVB照射组相比，细胞中LC3-II/LC3-I比率无改变(P>0.05),Beclin-1蛋白表达水平差异有显著统计学意义(P<0.01)（图4）。
2.5　UVB照射诱导ARPE-19细胞死亡不受细胞自噬变化的影响UVB照射组使用UVB照射ARPE-19细胞后24 h检测细胞生存率，结果显示，UVB诱导后细胞死亡率约25%，与对照组相比差异有显著统计学意义（P<0.01）；RAPA诱导了细胞死亡，RAPA组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；NH₄Cl不影响细胞生存，NH₄Cl组与对照组相比，细胞死亡率差异无统计学意义（P>0.05）;与UVB照射组相比,UVB+RAPA组和UVB+NH₄Cl组细胞死亡率无明显差异（P>0.05)（图5）。







3　讨论
????????AMD患者视力的缺失与RPE细胞和感光细胞的退化有关^［12］,RPE是一个极化的单层上皮细胞层，位于神经视网膜和脉络膜之间，能够选择性吸收较低波长的光粒子，因此，RPE是UVB的主要感受器细胞。有研究表明，UVB可通过激活MAP信号通路诱导细胞凋亡^［13］，并导致大鼠视网膜蛋白质组与能量稳态破坏、氧化应激、DNA损伤反应以及光感受器基质成分及其细胞表面受体结构和功能损伤^［14］。UVB可导致RPE细胞活性氧(ROS)升高，激活Notch通路损伤RPE细胞^［15］。尽管大量的研究对UVB导致AMD发生的机制进行了探索，但确切的发生机制仍然有待研究。
????????UVB照射产生的氧化应激可以引起RPE细胞内蛋白错误折叠及蛋白聚集，这与AMD的发生密切相关^［10］。细胞中降解受损及不需要蛋白的途径主要是UPS和ALP，其中ALP与AMD发生的关系近年来得到了大家的广泛关注，越来越多的研究证实AMD中自噬功能异常^［8,10］。自噬是一种细胞保护过程，在各种压力下维持稳态，消除有缺陷的蛋白质和受损的细胞器。自噬在细胞中具有多重作用，上调自噬可导致细胞死亡^［16］，自噬功能的损害可导致许多疾病的发生^［17］，包括AMD^［18］。在皮肤细胞中，UVB与自噬的关系的研究较多，但得到的结果完全不同：在人真皮成纤维细胞及角化细胞中UVB照射损伤了自噬^［19-20］；然而另外的研究认为，UVB照射诱导了人真皮成纤维细胞和角化细胞的自噬^［21-23］，而且在小鼠表皮细胞中得到了同样的结论^［24］。造成不同结果的原因尚未完全清楚，但是自噬的调节过程受到多种因素的影响。因此，在不同条件下，不同组织、不同细胞中自噬的变化是多样的。
????????本研究结果显示，UVB照射降低了ARPE-19细胞中，LC3-II/LC3-I比率，LC3-I向LC3-II转换减少，提示自噬流下降；降低了Beclin-1蛋白表达水平，因为Beclin-1蛋白是自噬体形成的关键材料，是自噬启动的标志之一^［25］，说明UVB照射抑制了自噬的启动。自噬增强剂RAPA可逆转了UVB照射降低的ARPE-19细胞中，LC3-II/LC3-I比率，自噬抑制剂NH₄Cl则增强了UVB照射导致的LC3-II/LC3-I减少，进一步证了UVB照射对于自噬流的抑制作用。虽然调节细胞自噬的复杂机制有待于确定，但两个调节系统已经明确，即mTOR/ULK1和Beclin-1/PI3K-Class III通路^［26］。 Beclin-1在调节细胞自噬中的作用比较复杂，连接的分子伴侣不同，导致其具有诱导或抑制细胞自噬相反作用^［27］。本研究中RAPA和NH₄Cl虽然降低了ARPE-19细胞中Beclin-1蛋白的表达，但是却一定程度地逆转了UVB照射的抑制作用。RAPA通过抑制mTOR通路激活细胞自噬，NH₄Cl通过阻止自噬体-溶酶体融合而抑制自噬，两种自噬调节剂具有相反的调节作用，由于作用的通路不同，因此，和UVB照射联合作用造成的压力可能在一定程度上刺激了Beclin-1蛋白反应性的表达增加，这需要未来更确切的证据进一步证明。
????????由于RPE细胞中自噬与UPS之间具有交互作用^［11］，UPS的抑制可以激活细胞自噬，但是细胞自噬的抑制则损害了UPS。为了观察UVB照射对于ARPE-19细胞自噬的作用是否受UPS的影响，我们应用蛋白酶抑制剂EPO作用于UVB照射后的ARPE-19细胞，观察自噬的变化，结果表明，EPO刺激细胞自噬的启动和自噬流的增加，对于由UVB照射所致的LC3-II/LC3-I比率降低没有影响，但对UVB照射所致的Beclin-1蛋白降低有一定的逆转作用。UPS对于UVB照射作用的影响在不同的阶段不尽相同，既不影响UVB照射抑制自噬流的作用，又可一定程度上逆转UVB照射对自噬启动的抑制。
????????有研究表明，细胞自噬的改变能够影响细胞生存^［16］，本研究结果显示，UVB照射照射诱导了ARPE-19细胞死亡，并且增强或抑制细胞自噬均无逆转UVB照射照射的作用，因此，我们认为UVB照射导致RPE细胞死亡与细胞自噬的改变无关。
????????综上，UVB照射可以抑制ARPE-19细胞自噬的启动及自噬流，UPS的改变不影响UVB照射对于自噬流的作用，但一定程度上减轻了UVB照射对细胞自噬启动的抑制。UVB照射通过诱导RPE细胞死亡、损害RPE细胞自噬能力增加变性，从而导致AMD的发生。