《眼科新进展》  2021年3期 206-211   出版日期：2021-03-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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补肾活血中药方血清对离体状态下血-视网膜内屏障模型的保护作用


糖尿病视网膜病变（DR）能导致糖尿病性黄斑水肿，进一步会引起患者视力丧失，是目前常见的眼底血管性疾病和主要的致盲原因^［1］。近年来，中医药治疗DR取得了较大进展。在长期的临床观察中人们发现，补肾活血中药方（由干地黄、丹参、人参、葛根配伍而成）能有效改善DR患者眼底病变，提高视力。血-视网膜内屏障（iBRB）是DR等视网膜血管性疾病发生的重要结构基础，iBRB受损是临床上和实验中DR共有的病理特征。秦学维^［2］通过在体模型研究发现，补肾活血中药方具有保护早期糖尿病大鼠iBRB，减轻视网膜水肿的作用。本研究探讨离体状态下补肾活血中药方血清对体外iBRB模型的保护作用，为临床更好地应用补肾活血中药方防治DR等视网膜血管性疾病提供一定的实验依据。
1　材料与方法　
1.1　实验动物及材料　取出生7 d SD大鼠50只，雌雄不限，均由第三军医大学实验动物中心提供，标准号为清洁级，用于取材及细胞原代培养。青霉素-链霉素溶液、免疫荧光一抗稀释液、免疫荧光二抗稀释液、DAPI、抗荧光淬灭剂、多聚赖氨酸溶液、乙醇（北京碧云天生物技术有限公司），DMEM、胎牛血清、I型胶原酶、胰蛋白酶、PBS（美国Gibco公司），小鼠IgG免疫磁珠、大鼠抗小鼠CD31（美国eBioscience公司），内皮细胞生长添加剂、糖基化终末产物（AGEs）、连二亚硫酸钠（美国Sigma公司），一抗Anti Occludin（兔来源）、一抗Anti ZO-1（兔来源）、二抗AntiAlexa Fluro 647（抗兔）、二抗Anti FITC（抗兔）（美国Abcam公司），0.22 μm混合纤维素滤膜、0.4 μm Transwell小室、Millicell ERS细胞电阻仪（美国Millipore公司），激光共聚焦显微镜（德国Leica公司），光学显微镜、照相系统（日本OLYMPUS公司），补肾活血中药方浸膏由成都中医药大学药学院制剂室提供。
1.2　方法　
1.2.1　大鼠视网膜微血管内皮细胞分离及传代培养　将出生7 d的SD大鼠脱颈处死，无菌条件下取出眼球，用体积分数75%乙醇浸泡15 min，用含有100 U·mL^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素的PBS冲洗3次后，放于DMEM液中，在显微镜下，收集视网膜。用PBS洗涤后切成小块，加入1 g·L^-1的I型胶原酶，37 ℃消化30 min，过滤，1000 r·min^-1离心5 min，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM重悬细胞。加入CD31抗体包被的免疫磁珠，4 ℃孵育30 min。继续1000 r·min^-1离心5 min后，将细胞重悬于含体积分数10%胎牛血清的DMEM中，转移至试管并放置在磁体中2 min。去除上清液，将试管移出分选架，按照上述方式再次重悬、分离细胞，收集沉淀。用含体积分数10%胎牛血清的DMEM洗涤结合磁珠的细胞4次，将细胞接种于0.1 g·L^-1的L-多聚赖氨酸溶液包被的培养板中，加入视网膜微血管内皮细胞（RMEC）培养液（含体积分数10%胎牛血清、100 U·mL^-1青霉素、100 mg·L^-1链霉素及100 mg·L^-1内皮细胞生长添加剂的DMEM培养液），置于体积分数5%CO₂、37 ℃的培养箱中培养。隔天换液，待细胞融合80%时，用PBS洗涤，加入2.5 g·L^-1胰蛋白酶消化2 min，用RMEC培养液终止消化，1000 r·min^-1离心10 min，收集细胞。将细胞以1×10⁶个·mL^-1的密度接种于培养瓶，置于培养箱继续培养传代^［3-4］。
1.2.2　大鼠视网膜Müller胶质细胞分离及传代培养　将出生7 d的SD大鼠脱颈处死，无菌条件下取出眼球，用体积分数75%乙醇浸泡15 min，用含有100 U·mL^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素的PBS冲洗3次后，放于DMEM液中，置于含体积分数5% CO₂、37 ℃培养箱过夜。用PBS洗涤后，加入2.5 g·L^-1胰蛋白酶37 ℃下消化1 h后，吸出消化液，加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液，终止消化。在显微镜下，收集视网膜组织。然后将视网膜组织反复吹打形成乳糜状，接种于培养瓶中，加入Müller细胞培养液（含体积分数20%胎牛血清、100 U·mL^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素的DMEM培养液），置于培养箱中培养。72 h后换液。传代方法及培养环境同RMEC^［5］。
1.2.3　体外iBRB模型的制备　取第三代大鼠RMEC，换液加入无血清培养基培养24 h。取第二代大鼠视网膜Müller胶质细胞（RMGC），换液加入RMEC培养液培养24 h。用10 g·L^-1明胶提前包被微孔膜，用2.5 g·L^-1胰蛋白酶分别消化两种细胞，制备细胞悬液。先将Transwell小室倒置，将RMGC以10×10³个·mL^-1的密度接种在小室外底面。置于培养箱中，等大部分RMGC贴壁后，翻转小室置于12孔板的孔中，将RMEC以20×10³个·mL^-1的密度接种在小室内底面，分别补充上下室培养液^［4］。用细胞电阻仪测量模型的跨内皮细胞电阻(TEER)，当TEER≥90 Ω·cm²时，模型构建成功。
1.2.4　补肾活血中药方血清的制备　另取20只体质量120～150 g的SD大鼠随机分成两组，分别为中药含药血清组、空白对照组，每组10只大鼠。中药含药血清组每天给予大鼠补肾活血中药方浸膏，给药剂量为11.67 g·kg^-1·d^-1，每天灌胃1次，连续7 d。空白对照组每天给予等体积的生理盐水。在末次给药1 h后，采大鼠腹主动脉血，将采集的血液于4 ℃静置24 h，3000 r·min^-1离心10 min后分离血清；将分离的血清置于56 ℃水中30 min灭活，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌、分装为5 mL，分别标记为中药含药血清和空白血清，-20 ℃保存备用^［6-7］。
1.2.5　实验分组及处理　本实验细胞分8组。选取构建成功的体外iBRB细胞共培养模型，按不同培养条件进行分组，其中正常对照组用含体积分数20%空白血清的DMEM液培养；中药干预正常组用含体积分数20%中药含药血清的DMEM液培养；低AGEs组用含体积分数20%空白血清的DMEM液及终浓度50 mg·L^-1 AGEs培养；中药干预低AGEs组用含体积分数20%中药含药血清的DMEM液及终浓度50 mg·L^-1AGEs培养；高AGEs组用含体积分数20%空白血清的DMEM液及终浓度100 mg·L^-1AGEs培养；中药干预高AGEs组用含体积分数20%中药含药血清的DMEM液及终浓度100 mg·L^-1AGEs培养；缺氧组用含体积分数20%空白血清的DMEM液及终浓度1.0 mmol·L^-1连二亚硫酸钠培养；中药干预缺氧组用含体积分数20%中药含药血清的DMEM液及终浓度1.0 mmol·L^-1连二亚硫酸钠培养。在各组培养24 h、48 h、72 h后分别进行实验指标的测定。
1.2.6　细胞电阻仪检测各组RMEC层的TEER　每次测量前先将Transwell上、下室中的培养液更换为新鲜培养液，然后用电阻仪进行检测。设备有两个电极，测量时将一个电极放上室，另一个放下室。首先用一个放有Transwell的无细胞培养的空白孔进行空白电阻值（R0）测定。然后测量各实验组电阻值，测量时每孔在3个不同点检测电阻值，计算平均值（Rt）。根据公式：TEER=（Rt-R0）×S计算TEER，S为小室的有效膜表面积。
1.2.7　免疫荧光双标法检测各组Occludin、ZO-1蛋白在RMEC层的表达　用PBS漂洗制备好的细胞爬片，40 g·L^-1多聚甲醛室温固定爬片，PBS浸洗3次，每次3 min。在爬片上滴加体积分数6%山羊血清，室温封闭30 min。用吸水纸吸掉封闭液，每张爬片上滴加一抗Occludin（稀释比1∶100）放入湿盒，4 ℃孵育过夜，复温30 min后用PBS浸洗3次，每次3 min，滴加荧光二抗647（稀释比1∶800），放湿盒中37 ℃孵育1 h。用PBS清洗爬片3次，每次3 min，继续滴加一抗ZO-1（稀释比1∶200），放湿盒中37 ℃孵育1 h；再用PBS清洗爬片3次，每次3 min，滴加荧光二抗FITC（稀释比1∶800），放湿盒中37 ℃孵育1 h。用PBS清洗爬片3次，每次3 min，滴加DAPI避光孵育15 min。最后用PBS清洗爬片4次，每次5 min，用抗荧光淬灭剂封片，在激光扫描共聚焦显微镜下观察并采集图像。
1.3　统计学方法　采用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　各组RMEC层TEER检测结果　在AGEs或缺氧条件下，低AGEs组、高AGEs组及缺氧组RMEC层TEER在细胞培养24 h、48 h和72 h后均低于正常对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。在细胞培养24 h后，中药干预正常组与正常对照组RMEC层TEER相比，差异无统计学意义（P>0.05），在细胞培养48 h后中药干预正常组RMEC层TEER高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），在细胞培养72 h后中药干预正常组RMEC层TEER低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；中药干预低AGEs组、中药干预高AGEs组、中药干预缺氧组RMEC层的TEER在细胞培养24 h、48 h和72 h后均高于同一时段相对应的非中药干预组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）（见表1）。



2.2　各组Occludin、ZO-1蛋白在RMEC层的表达情况　免疫荧光双标法检测结果显示：低AGEs组、高AGEs组及缺氧组Occludin、ZO-1蛋白在RMEC层的阳性表达在细胞培养24 h、48 h和72 h后均弱于正常对照组。在细胞培养24 h、48 h和72 h后中药干预正常组、中药干预低AGEs组、中药干预高AGEs组、中药干预缺氧组Occludin、ZO-1蛋白在RMEC层的阳性表达均强于同一时段相对应的非中药干预组（见图1）。



3　讨论
DR是多种因素共同作用的结果，其中AGEs是机体在长期慢性高血糖状态下产生的一种终末产物，AGEs的形成与堆积是DR微血管病变的独立危险因素^［8］。此外，缺氧在DR发生中也具有重要的作用，是DR的主要发病机制之一^［9-12］。
????????iBRB是DR等视网膜血管性疾病的重要结构基础，它对于调节视网膜微环境的平衡，维持视网膜的正常代谢以及结构和功能的完整性起到了至关重要的作用^［13-14］。iBRB是由相邻的视网膜毛细血管内皮细胞紧密连接形成^［15］。目前iBRB模型的体外研究，大部分采用RMEC单独培养的模型。研究表明，Müller细胞能诱导血管内皮细胞形成屏障，在视网膜血管屏障的形成中起着重要作用^［16］。RMGC在RMEC由非屏障细胞向屏障细胞转变的诱导和维持中扮演着积极的角色。为了更好地模拟iBRB，本实验将RMGC和RMEC共培养构建了体外iBRB细胞模型。研究显示，在这种三维培养模型中，RMGC可以诱导RMEC相互间形成紧密连接，并有紧密连接蛋白表达和高TEER等特征^［4］。本实验中构造低AGEs、高AGEs及缺氧等条件，旨在观察处于不同病理状态下的体外iBRB模型通透性的变化，并以补肾活血中药方血清进行干预，探讨补肾活血中药方血清对不同病理条件下体外iBRB的保护作用，为临床更好地应用补肾活血中药方防治DR等视网膜血管性疾病提供实验基础。
????????iBRB的完整性和通透性可通过TEER和细胞旁通透性来进行评估^［17］。其中TEER是内皮组织屏障完整性的良好指标，是评估紧密连接的离子运输和屏障通透性的有效工具^［18］。iBRB的破坏是DR早期的特征性病理学改变，会导致屏障通透性升高，加重了屏障的渗漏。本实验结果显示：在细胞培养24 h、48 h和72 h后，低AGEs组、高AGEs组及缺氧组RMEC层的TEER均低于正常对照组（均为P<0.05），说明低AGEs、高AGEs及缺氧条件都可以导致体外iBRB功能受损，此时屏障通透性增加，渗漏加重，导致TEER下降。已有研究证实TEER与内皮细胞通透率成反比^［19-20］，本研究结果与这一观点相一致。
????????中药干预低AGEs组、中药干预高AGEs组、中药干预缺氧组RMEC层TEER在细胞培养24 h、48 h和72 h后均高于同一时段相对应的非中药干预组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。这说明补肾活血中药方血清能减轻iBRB屏障的损伤，降低模型通透性增加的程度，抑制了屏障渗漏进一步加重过程，从而升高了TEER。
????????本实验结果还显示：在细胞培养24 h后，中药干预正常组与正常对照组的TEER相比，差异无统计学意义（P>0.05）；在细胞培养48 h后中药干预正常组的TEER高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；在细胞培养72 h后中药干预正常组的TEER低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。据此我们推测，补肾活血中药方血清不仅对病理条件下的细胞有保护作用，也对正常细胞也有一定的影响，但这种影响有一定的时效性，在细胞培养48 h时影响最大。
????????内皮细胞间广泛的紧密连接既是iBRB的重要组成部分，也是细胞旁路径的结构基础^［21］。其中，Occludin和ZO-1蛋白是非常关键的两种紧密连接蛋白，对紧密连接结构和功能的稳定起着重要作用^［22-24］。紧密连接蛋白表达量的变化、在细胞内的位置分布变化和（或）结构功能的异常均能破坏紧密连接的完整性，引起细胞间连接开放，导致血管内皮通透性增高^［25］。本研究结果显示：低AGEs组、高AGEs组及缺氧组Occludin、ZO-1蛋白在RMEC层的阳性表达在细胞培养24 h、48 h和72 h后均弱于正常对照组，说明低AGEs、高AGEs及缺氧均会造成体外iBRB细胞间的紧密连接受损，细胞内紧密连接蛋白表达减弱，这是导致病理条件下iBRB细胞模型通透性增加的一个重要原因。此外，本研究发现，在细胞培养24 h、48 h和72 h后，中药干预正常组、中药干预低AGEs组、中药干预高AGEs组、中药干预缺氧组Occludin、ZO-1蛋白在RMEC层的阳性表达均强于同一时段相对应的非中药干预组，说明补肾活血中药方血清通过提高Occludin和ZO-1蛋白的表达，来修复AGEs及缺氧条件下体外iBRB模型紧密连接的损伤。
????????综上所述，本实验通过检测体外iBRB模型的TEER及紧密连接蛋白Occludin、ZO-1的表达发现，AGEs及缺氧等不同病理状态均可使体外iBRB细胞模型的TEER降低，紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达下降（提示模型通透性的增加）；而补肾活血中药方血清能有效提高Occludin和ZO-1蛋白的表达，抑制iBRB模型通透性增加，减轻iBRB屏障渗漏。这可能是补肾活血中药方在AGEs及缺氧条件下降低iBRB模型通透性的一个重要干预途径。