《眼科新进展》  2020年12期 1106-1109   出版日期：2020-12-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
电针刺激对单眼形觉剥夺弱视大鼠初级视皮层中多巴胺、γ-氨基丁酸及其受体mRNA表达的影响


弱视是一种与初级视皮层发育有关的儿童常见眼病［1］，该病是由早期视觉发育异常（单眼斜视、屈光参差、高度屈光不正及形觉剥夺等）所引起，患儿单眼或双眼最佳矫正视力低于正常儿童，但眼部检查无器质性病变。近年来，随着弱视患病率的不断升高［2-5］，研究弱视的发病机制及治疗方法显得尤为重要。针灸作为一种治疗弱视的辅助方法，在临床上取得了较好的效果，但关于针灸治疗弱视的分子生物学机制研究较少。目前，研究显示多巴胺（dopamine,DA）、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）是弱视发病机制中主要的中枢神经调控递质，可参与视觉发育敏感期初级视皮层突触的可塑性过程［6-7］。本研究探讨电针刺激对单眼形觉剥夺弱视大鼠初级视皮层中DA、GABA的含量及其受体（D1受体和GABAA受体）mRNA表达的影响，初步分析电针治疗弱视的分子生物学机制，为临床针灸治疗弱视提供一定的理论依据。
1　 材料与方法　
1.1　实验动物　健康SD大鼠36只，体质量（12±2）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011。实验动物的饲养和使用得到山东中医药大学眼科研究所动物管理和使用委员会的批准。
1.2　主要试剂及仪器　DA（德国 Dr.Ehrenstorfer公司），GABA标准品（美国 Sigma公司），组织/细胞RNA快速提取试剂盒（北京艾来德生物有限公司），cDNA逆转录试剂盒、2×SYBR Green I试剂盒（美国 Roche公司），高效液相色谱-紫外检测器Dionex UltiMate 3000（德国戴安公司），ACCLARM120C18色谱柱（美国 Waters公司），实时荧光定量PCR仪（美国Roche公司），脑切片模具（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。
1.3　方法　
1.3.1　大鼠单眼形觉剥夺弱视模型的建立　将鼠龄13 d的大鼠（尚未睁眼）随机分为3组：正常对照组、弱视模型组、电针治疗组，每组12只。正常对照组大鼠不做任何处理，弱视模型组、电针治疗组大鼠右眼参照文献［8］进行单眼形觉剥夺弱视造模。其具体操作方法为：腹腔注射10 g?L-1戊巴比妥钠（40 mg?kg-1）将大鼠麻醉后，用生理盐水对右眼进行彻底清洁，剪除上、下眼睑各0.8~1.0 mm，并用眼科带线缝合针分层缝合。术后3 d在缝合处涂氧氟沙星及红霉素眼膏防止感染，同时，检查是否出现脱线、漏光及感染等情况，出现上述情况不再纳入后续实验。三组大鼠均在自然光下饲养45 d后，剪开右眼眼睑。
1.3.2　电针刺激干预　电针治疗组大鼠在生后30~60 d选取左侧太阳、合谷，右侧太阳、攒竹进行电针刺激干预，百会和右侧合谷仅给予针刺，不通电。每天同一时间段电针刺激干预30 min，频率2 Hz，脉冲长度0.1 s，每周至少干预6 d。
1.3.3　取材　将大鼠腹腔注射10 g?L-1戊巴比妥钠（40 mg?kg-1）麻醉后，快速断头取脑组织，放于脑切片模具中，参考大鼠脑立体定位图谱［9］，以海马附近的胼胝体白质为标志截取大鼠左侧初级视皮层，转移至EP管中，-80 ℃保存备用。
1.3.4　各组大鼠初级视皮层中DA、GABA含量检测　分别精密称取适量的DA、GABA标准品，放于10 mL定量瓶中，加0.1 mol?L-1的高氯酸溶解并定容到刻度线，作为储备液。每组分别取6只大鼠初级视皮层，按质量体积比（1 mg∶10 μL）加蒸馏水，于冰上充分研磨制备成匀浆液。在4 ℃、1500 r?min-1离心20 min，取上清，再以相同的转速离心20 min，取上清进样测定。
????????采用高效液相色谱-紫外检测器及WatersC18（2.1 mm×150.0 mm,3 μm）色谱柱进行检测。流动相A为925 mL醋酸钠缓冲液（0.15 mol?L-1），加醋酸调制pH为6.5，然后加乙腈75 mL混匀；流动相B为乙腈、甲醇、水的混合液，体积比为 3∶1∶1。柱温为30 ℃，流速为1 mL?min-1，检测波长为254 nm。梯度洗脱：0 min、100% A，6 min、94% A，15 min、91% A，20 min、55% A，30 min、0% A，35 min、100% A；根据色谱图峰面积计算各组大鼠初级视皮层中DA、GABA含量。
1.3.5　各组大鼠初级视皮层中D1受体、GABAA受体 mRNA表达的检测　每组分别取6只大鼠初级视皮层组织，根据组织/细胞RNA快速提取试剂盒说明书进行总RNA的提取，使用cDNA逆转录试剂盒进行cDNA的合成。采用实时荧光定量PCR仪检测D1受体、GABAA受体 mRNA的表达，以β-actin作为反应的内参。利用DNA Star软件设计引物序列并由上海生工生物工程股份有限公司进行合成，相关引物序列见表1。采用2-△△Ct方法对各组结果进行分析，将正常对照组的目的基因相对表达量设为1。



1.4　统计学分析　采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，所得数据用x?±s来表示。采用单因素方差分析对3组各指标差异进行统计学检验，用LSD-t检验进行组间两两比较。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　各组大鼠初级视皮层中DA、GABA的含量　检测结果显示，弱视模型组大鼠初级视皮层中DA、GABA的含量均低于正常对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；电针治疗组DA的含量低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而GABA的含量与正常对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。电针治疗组大鼠初级视皮层中DA、GABA的含量均高于弱视模型组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）（见图1）。由此可见，单眼形觉剥夺弱视可造成大鼠大脑初级视皮层中DA、GABA的分泌异常，电针治疗后可显著改善这种异常的表达。



2.2　各组大鼠初级视皮层中D1受体、mRNA、GABAA受体 mRNA的表达　检测结果显示，弱视模型组和电针治疗组大鼠初级视皮层中D1受体、GABAA受体 mRNA的表达均低于正常对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；电针治疗组GABAA受体 mRNA的表达高于弱视模型组，差异有统计学意义（P<0.05），而D1受体 mRNA的表达与弱视模型组相比差异无统计学意义（P>0.05）（见图2）。提示电针可正向调节GABAA受体 mRNA的表达，提高大鼠初级视皮层突触的可塑性，从而起到治疗弱视的作用。



3　讨论
????????人和哺乳动物的视觉发育不仅受自身因素的影响［10］，还与外部环境刺激有关。在视觉发育的敏感期，视觉系统可根据视觉环境的刺激调整和改变初级视皮层神经元之间的连接，即突触结构［11］。在此阶段，若两眼接受相同程度的视觉信号输入，则双侧初级视皮层内的神经元和突触可保持平衡；反之，这种平衡将被打破，从而表现出两眼视觉上的差异，此时眼优势柱向接受信号多的一眼转移。本实验在大鼠视觉发育关键期进行单眼缝合，这种异常的视觉经验削弱了光线对视网膜的刺激，使视觉通路不能有效地将神经冲动传递到缝合眼的初级视皮层，引起缝合眼对侧视皮层神经元及突触结构发生改变［12］，从而导致与视觉发育相关的神经递质、调质分泌出现异常［13］。以往的研究显示，弱视可导致初级视皮层结构和功能的异常，因此，深入研究初级视皮层在弱视发生过程中的作用意义重大，且可为临床防治弱视提供一定的理论依据。
????????目前，绝大多数研究者认为，DA及GABA存在于初级视皮层中，并调控视觉发育敏感期内初级视皮层突触的可塑性。Li等［14］研究发现，弱视猫初级视皮层中存在DA减少的现象，增加DA的含量可改善初级视皮层的结构，并抑制皮层组织内神经元的损伤。Razeghinejad等［15］研究发现，单剂量的左旋多巴可穿过血-脑屏障转换为DA，从而治疗弱视，改善弱视患者的双眼视功能。
????????在大脑初级视皮层的发育过程中，兴奋性神经递质与抑制性神经递质保持相对平衡是控制视觉发育敏感期开始和结束的关键。GABA是最早被发现的与初级视皮层可塑性有密切关系的抑制性神经递质［16］，且广泛分布于哺乳动物中枢神经系统。研究显示，缺乏GABA合成酶的小鼠初级视皮层不具备可塑性，在初级视皮层内注射GABA激动剂可使GABA合成酶基因缺失的小鼠重新表现出初级视皮层的可塑性。与上述结果一致，Leventhal等［17］研究发现，使用GABAA受体拮抗剂可抑制青壮年猴的视觉功能，而GABA、GABAA受体激动剂可提高老年猴的视觉功能。同时，邵立功等［18］对单眼形觉剥夺猫进行研究发现，剥夺眼对侧视皮层GABA神经元数量较正常眼明显减少。此外，GABA受体还可能参与视皮层眼优势柱的转移［19-20］。
????????针灸治疗弱视在临床上已取得肯定疗效，但其治疗机制尚不清楚［21］。本研究对弱视大鼠进行电针刺激干预，结果显示，建模后弱视大鼠初级视皮层中DA、GABA的含量及其受体mRNA表达均下调，而在电针治疗组中两者的含量及其GABAA受体mRNA表达均呈恢复性上调，提示弱视的发生、发展确实与初级视皮层中DA、GABA及其GABAA受体 mRNA的表达关系密切，电针治疗弱视可能是通过提高DA、GABA及其GABAA受体 mRNA表达来发挥作用的。由上述结果我们可以得出，视觉发育过程中若遭遇异常的视觉经验（如单眼形觉剥夺），可引起初级视皮层接收到的视觉刺激减少，导致神经冲动减弱甚至丧失［22］，造成与视觉发育有关的神经递质分泌出现异常，如初级视皮层DA、GABA含量降低，长期的视觉剥夺使视觉系统的传输能力逐渐处于休眠状态［23］，最终形成弱视。而采用针刺干预可使初级视皮层中DA和GABA表达上调，进而激活休眠状态下的视觉通路及神经传输系统，改善视觉转导状态，恢复视觉发育的可塑性［24］，使弱视眼视功能得到改善。