《眼科新进展》  2020年9期 822-825   出版日期：2020-09-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
上调microRNA-27b对血小板衍生因子诱导下的人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用


????????视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）是保护视网膜光感受器外层和脉络膜脉管系统的外屏障［1］，RPE细胞的异常增殖和迁移是年龄相关性黄斑变性（AMD）、增生型糖尿病视网膜病变（PDR）和增生性玻璃体视网膜病变（PVR）等多种眼部疾病共同的病理基础［2-4］。microRNA（miRNA）是一类短（19~24个核苷酸）的非蛋白质RNA，通过与目标mRNA的3’-非翻译区（3’-UTR）结合，对转录后的基因表达产生负调控，抑制或降解mRNA［5］。miRNA在复杂的生理过程（包括炎症、血管生成、增殖和凋亡）的调控机制中起着至关重要的作用［6］，前期研究观察到氧化应激下RPE细胞中的microRNA-27b(miR-27b)下调［7］，但miR-27b在RPE细胞增殖中的作用仍未完全清楚。本研究探讨在对血小板衍生因子（platelet-derived growth factor,PDGF）作用下miR-27b对ARPE-19细胞增殖的调控作用，旨在为临床上与RPE细胞增殖有关的眼科疾病的治疗提供新的思路。
1　材料与方法　
1.1　材料　ARPE-19细胞(美国ATCC公司）；DMEM/F12培养液、Lipofectamine 2000转染试剂盒、TRIZOL（美国Invitrogen公司）；TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒、TaqMan microRNA分析试剂盒（美国Applied Biosystems公司）；抗cyclinD1抗体（CST 2922）、抗CDK4抗体（ab108357）、抗p21CIP1抗体（ab109520）、抗p27KIP1抗体（CST 3686）、内参β-肌动蛋白（ab8226）（美国Abcam公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；miR-27b模拟物、miR-27b阴性对照（NC）过表达质粒（上海吉玛制药技术公司）；PDGF（美国R&D System公司）； MTT（美国Sigma公司）；流式细胞仪（美国BD公司）。
1.2　方法
1.2.1　ARPE-19细胞培养　ARPE-19细胞常规复苏后，将细胞置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中，于CO2恒温培养箱中培养，细胞融合至80%时进行传代，取3～6代细胞用于实验。
1.2.2　细胞转染及分组　培养ARPE-19细胞，并使用Lipofectamine 2000试剂将miR-27b模拟物（mimics）、miR-27b NC质粒或空载体转染入ARPE-19细胞。转染36 h后用重组人PDGF（20 μg·L-1)处理5 h。根据转染物不同，将实验分为空白对照组（control组）、miR-27b阴性对照组（miR-27b NC组）、miR-27b模拟物转染组（PDGF+mimics组）和空载体转染组（PDGF+NC组）。
1.2.3　实时荧光定量PCR检测　使用TRIZOL试剂处理ARPE-19细胞。 使用TaqMan microRNA逆转录试剂盒合成cDNA。 使用TaqMan microRNA分析试剂盒进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-27b表达水平，使用U6进行标准化。 使用2-△△Ct方法计算miR-27b相对表达量。
1.2.4　MTT检测细胞活性　将处于对数生长期的ARPE-19细胞，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液配成单细胞悬液，以每孔2×103个细胞接种到96孔板，在含体积分数5%CO2培养箱中，37 ℃孵育24 h、48 h、72 h。用miR-27b模拟物或NC转染ARPE-19细胞36 h后加入PDGF刺激5 h，每孔加入20 μL终浓度为 5 g·L-1 MTT溶液并于37 ℃温育4 h。小心弃上清，每孔加入100 μL裂解液孵育过夜，使结晶物充分融解；选择490 nm波长，分光光度计检测两组各孔光密度（D）值，记录结果。
1.2.5　流式细胞术检测细胞周期　通过流式细胞术测定各组的细胞周期。用PBS洗涤细胞,1000 r·min-1离心5 min，弃上清液，然后在4 ℃下用体积分数70%冷乙醇再悬浮固定30 min,加入50 g·L-1 Rnase A，在37 ℃下孵育1 h，然后在4 ℃避光加入50 μL碘化丙二钠（PI）溶液染色30 min，通过流式细胞仪检测各组的细胞周期分布情况。
1.2.6　Western blot 检测各种因子蛋白表达　收集ARPE-19细胞并在RIPA缓冲液中裂解，然后在4 ℃以14 000 r·min-1离心15 min。上清液的蛋白质浓度使用Bradford分析法。转膜，在室温下用50 g·L-1脱脂牛奶封闭1 h后，将膜与cyclinD1（1∶500）、CDK4（1∶1000）、p21CIP1（1∶1000）、p27KIP1（1∶1000）和内参β-肌动蛋白（1∶1000）在4 ℃过夜后漂洗。将膜与辣根过氧化物酶结合的二抗（1∶1000）在37 ℃下孵育1 h。用增强的化学发光试剂检测蛋白条带，并用ImageJ系统定量。 β-肌动蛋白为内参。
1.3　统计学方法　所有数据均采用均数±标准差表示。使用GraphPad Prism 5.0进行统计分析。采用单因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni事后检验进行统计学分析。每个实验重复三次。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　qRT-PCR检测miR-27b表达水平　生长融合至80%~90%的ARPE-19细胞呈现出与典型鹅卵石形态一致的天然RPE细胞的结构特征（图1A）。qRT-PCR检测结果显示：经PDGF处理5 h，与miR-27b NC组相比，PDGF+NC组miR-27b的表达显著降低（P<0.01）；与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组APRE-19细胞miR-27b表达增加（P<0.01，图1B）。



2.2　MTT法检测ARPE-19细胞活性　MTT检测结果显示：与miR-27b NC组和空白对照组相比，PDGF+NC组48 h和72 h APRE-19细胞的D值均显著增加（均为P<0.01）；而与PDGF+NC组相比，miR-27b过表达的PDGF+mimics组 APRE-19细胞的D值明显降低（P<0.01）（见图2）。



2.3　miR-27b过表达对ARPE-19细胞周期的调控作用　与空白对照组和miR-27b NC组相比，PDGF+NC组G0/G1期细胞的百分比显著降低，S期细胞的百分比显著增加（均为P<0.05）；而与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组可显著增加G0/G1期的细胞百分比，抑制S期的细胞百分比，抑制了细胞增殖（均为P<0.05）（见图3）。此外，Western blot检测结果还显示：与miR-27b NC组相比，PDGF+NC组cyclinD1蛋白和CDK4蛋白的表达水平均显著增加，p21CIP1蛋白和p27KIP1蛋白的表达均下降（均为P<0.05）；与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组cyclinD1蛋白和CDK4蛋白的表达均降低，p21CIP1蛋白和p27KIP1蛋白的表达均增加（均为P<0.05）（见图4）。







3　讨论
????????正常情况下，RPE细胞是静止的，具有不增殖、不迁移和良好的细胞间通讯连接［8］；病理条件下，RPE细胞可迁移到玻璃体内和视网膜表面，诱发脉络膜或视网膜新生血管膜形成，促进PDR和PVR等多种严重视觉损伤疾病的发生［2,9］。RPE细胞增殖和迁移涉及多种生长因子和细胞因子，其中RPE细胞产生的PDGF已被确定为RPE细胞增殖的主要有丝分裂原和促细胞分裂剂，参与各种视网膜疾病的发生［10-11］。进一步了解PDGF诱导的RPE细胞增殖和迁移的机制是非常必要的。
????????miR-27b是一种内含子miRNA，参与多种生物学过程，包括脂质代谢、2型糖尿病和胰岛素抵抗，与癌症也相关［12-14］。已有研究表明，各种miRNA，如miR-204、miR-211、miR-34a、miR-184和miR-222，参与了眼部疾病中RPE细胞的增殖和分化［15-16］。本研究中PDGF可增强ARPE-19细胞活性，促进细胞增殖。PDGF处理后异常增殖的ARPE细胞中miR-27b表达也明显下调。MTT检测结果发现：miR-27b过表达可使ARPE-19细胞D值明显下降，抑制细胞活性。因此，我们认为ARPE-19的异常增殖与miR-27b的下调可能有关。同时，从细胞周期的G1/G0期到S期的准确过渡是细胞增殖的关键步骤，这主要受有丝分裂信号转导靶向标志物诸如细胞周期蛋白（cyclinD1、D2、D3，cyclinE）的刺激，细胞周期蛋白与细胞周期蛋白结合依赖性激酶（CDK2和CDK4）促进细胞周期向DNA复制期发展［17］。 p21CIP1蛋白和p27KIP1蛋白属于CDK抑制剂的CIP/KIp家族，可灭活细胞周期蛋白-CDK复合物并随后抑制DNA合成［18］。本研究中，miR-27b模拟物转染ARPE-19细胞，使之过表达miR-27b，可以显著抑制PDGF诱导的ARPE-19细胞周期从G0/G1到S期的转变，使cyclinD1蛋白和CDK4蛋白的表达降低，p21CIP1蛋白和p27KIP1蛋白的表达增加，抑制细胞增殖。
????????miR-27b也被发现参与血管生成。Veliceasa等［19］证明，miR-27b在心脏血管生成中具有促血管生成作用；但也有学者发现，miR-27b通过靶向VEGF-C抑制胃癌和大肠癌的血管生成［20］。本研究中，我们发现在PDGF刺激下ARPE-19细胞中miR-27b表达显著降低，这可能与血-视网膜屏障的存在、miRNAs的表达和功能在眼内有严格的组织特异性有关［21］。
????????综上所述，在PDGF的诱导下，miR-27b在ARPE-19细胞中表达下调。同时，miR-27b的过表达可抑制细胞活性，调控细胞周期，部分抑制了PDGF诱导的ARPE细胞增殖。因此，miR-27b有可能是抑制ARPE细胞增殖的潜在候选物，从而为相关疾病的治疗提供新的靶点。 而miR-27b的过表达对PDGF诱导下ARPE-19细胞迁徙能力的影响，靶基因以及信号通路的调控机制将作为我们后续研究的内容。