《眼科新进展》  2020年7期 625-630   出版日期：2020-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
PACAP38调控TRPC6表达对糖尿病视网膜病变大鼠的保护作用


????????糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病中最常见的微血管并发症之一，也是导致患者视力丧失的主要原因［1］，迄今为止，DR的发病机制尚未完全阐明。近年来有研究发现，垂体腺苷酸环化酶激活肽-38（pituitary adenylate cyclase-activating peptide-38，PACAP38）作为一种具有潜在价值的新型神经肽，对DR期间发生的一些病理生理变化具有保护作用［2-3］。PACAP38可改善谷氨酸诱导的神经毒性形态，抵消了由于近紫外线UVA辐射损伤引起的感光细胞退化，以及在高血糖早期通过调节炎性/低氧性事件保护血-视网膜屏障［4-5］。有研究报道，瞬时受体电位通道6（transient receptor potential channel 6，TRPC6）的过表达在DR发病过程中对大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）具有损伤作用［6］。在哺乳动物TRP超家族中，经典受体TRPC6在多种生物中表达，并表现出多种生理功能［7］。研究发现，TRPC6-/-小鼠免受高血糖诱发的血管退化，并对STZ诱导的视网膜层具有保护作用［7］。最新研究发现，一些肽的生物活性是通过瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）介导实现的，如神经元的抗凋亡作用、促进肺癌细胞增殖、角膜上皮和内皮的伤口愈合［8-9］。但有关PACAP38与TRPC6保护DR的关系目前尚不清楚。因此，本研究通过建立大鼠DR模型以及体外视神经RGC-5细胞模型，初步探讨PACAP38在DR过程中的视网膜保护作用是否由TRPC6介导实现的。
1　材料与方法　
1.1　材料　链脲佐菌素（STZ）、PACAP38（美国Sigma Aldrich公司），MicronⅣ视网膜影像系统（美国Phoenix Research Lab），GenTeal凝胶（美国Novartis公司），光学显微镜（德国Zeiss Axioplan公司），RIPA裂解液（瑞士Roche Diagnostics公司），BCA蛋白质检测试剂盒（美国Pierce公司），山羊抗TRPC6、鼠抗β-actin一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗IgG（美国Santa Cruz Biotechnology公司），MTT试剂盒与超敏ECL试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），胎牛血清FBS（美国HyClone公司），DMEM/F12完全培养基（美国Thermo Scientific公司）等。
1.2　方法　
1.2.1　动物饲养　6~8周龄SPF级健康雄性SD大鼠30只，体质量100～120 g，购自上海SIPPR/BK实验动物有限公司（动物合格证编号：SCXK2008-0016）。将其饲养于温度为25~28 ℃、相对湿度为70%~85%、明/暗周期为12 h的标准化动物实验室，自由进食与饮水。
1.2.2　动物模型的构建及分组　将SD大鼠分为空白对照组及DR模型组（STZ组），每组15只。大鼠糖尿病模型是通过单次腹腔注射STZ构建的。具体操作：注射STZ前大鼠禁食12 h，取适量STZ溶于柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5），按照60 mg·kg-1体质量对大鼠进行一次性腹腔注射。对照组大鼠注射相同体积的柠檬酸钠缓冲液。药物注射48 h后检测大鼠血糖，其血糖浓度超过16.7 mmol·L-1、尿量及饮水明显增多即视为建模成功。STZ组根据不同的干预措施，再进行分组。注射STZ后2周，一次性向大鼠一眼玻璃体内注射含100 μmol·L-1 PACAP38 PBS溶液4 μL，为STZ+PACAP38组；另一眼以同样的方法注射相同体积的PBS作为对照，为STZ对照组。注射PACAP38 6周后，腹腔注射致死量的戊巴比妥钠使各组大鼠安乐死，立即收集大鼠视网膜组织，一部分置于冰冻缓冲液中匀浆，进行Western blot检测，另一部分置于40 g·L-1多聚甲醛中固定，用于后续免疫组织化学分析。
1.2.3　光学相干断层扫描　应用MicronⅣ视网膜影像系统分别在注射前及PACAP38注射后3周、6周对各组大鼠进行光学相干断层扫描（OCT）以确定大鼠视网膜厚度。具体操作：将大鼠麻醉，用10 g·L-1托品酰胺滴眼散大瞳孔。用GenTeal凝胶润滑角膜，并将Micron目镜置于凝胶与眼睛直接接触的位置。使用全扫描设置以平均10帧·s-1扫描速度捕获OCT图像。每只眼睛在相对于视神经上、下和鼻、颞方向各拍摄3张图像。
1.2.4　免疫组织化学分析　取固定于40 g·L-1多聚甲醛的视网膜组织，用石蜡包埋，常规切片（厚3 μm），脱蜡、水化，并将切片置于体积分数0.3% H2O2/甲醇溶液中孵育30 min以淬灭内源性过氧化物酶活性，随后用PBS漂洗20 min。将切片用PBS中的体积分数1%牛血清白蛋白（BSA）处理1 h以减少非特异性染色，4 ℃下与山羊抗TRPC6孵育过夜（1∶100）。PBS漂洗后将切片于室温下辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1000）孵育10 min，PBS冲洗后与二氨基联苯胺孵育5 min，苏木精复染。取染色的部分切片进行脱水、透化，最后用中性树脂封片，于光学显微镜下观察。
1.2.5　Western blot检测各组大鼠视网膜组织中TRPC6的表达　收集各组大鼠视网膜组织，取适量置于含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中冰浴进行裂解，低温离心收集上清液。采用BCA蛋白质检测试剂盒测定各组大鼠视网膜组织中蛋白质浓度。调整各组蛋白样本35 μg进行上样，采用100 g·L-1SDS-PAGE分离胶进行电泳，随后采用湿法转膜将蛋白质转移于PVDF膜。将膜用50 g·L-1脱脂牛奶在室温下封闭2 h，随后将PVDF膜分别置于含山羊抗TRPC6（1∶800）和兔抗β-actin（1∶1000）一抗稀释液中4 ℃下孵育过夜。第2天用TBST漂洗3次，每次10 min，室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液中（1∶5000）孵育1 h。TBST漂洗同前。采用超敏ECL试剂盒（上海碧云天生物公司）显影曝光，采用自动图像分析系统对蛋白质条带进行扫描和光密度分析，以β-actin作为内参，进行统计分析。实验独立重复3次。
1.3　RGC-5细胞培养　人RGC-5细胞购自美国ATCC公司，将其置于含有体积分数10%胎牛血清、100×103 U·L-1青霉素和100×103 U·L-1链霉素的DMEM/F12完全培养基中，置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养。每1~2 d换液1次，每周按照1∶2的比例传代培养1次，取传至3代对数生长期的细胞用于后续实验。
1.3.1　RGC-5细胞分组及处理　取对数生长期的RGC-5细胞，用胰蛋白酶消化后，调整细胞密度为500×103 个·mL-1接种于HTS Transwell渗透板上培养7 d，隔天换液。随后，将Transwell渗透板中一半的细胞用含5.5 mmol·L-1 D-葡萄糖DMEM/F12完全培养基继续培养7 d，作为对照（NG)组；另一半细胞用含25 mmol·L-1 D-葡萄糖DMEM/F12培养液继续培养7 d，作为高葡萄糖（HG）组。
????????收集部分HG组细胞，调整细胞浓度为5000个·mL-1接种于96孔板中，用含25 mmol·L-1 D-葡萄糖DMEM/F12培养液培养过夜。第2天弃去原有培养基，用单独含100 μmol·L-1低氧模拟剂去铁胺（desferrioxamine，DFO）或分别联合含100 nmol·L-1 PACAP38、100 nmol·L-1 TRPC6通道激动剂（OAG）、10 μmol·L-1 PAC1受体拮抗剂（PACAP6-38）、20 nmol·L-1 TRPC6通道阻滞剂（SKF96365）的高糖DMEM/F12培养液培养24 h。NG组细胞以相同的密度接种于96孔板中，用含5.5 mmol·L-1 D-葡萄糖DMEM/F12完全培养基于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中继续培养。实验结束后，用MTT法检测各组细胞的活性。
1.3.2　MTT法检测各组RGC-5细胞的活力　每孔按照20 μL MTT溶液（0.5 g·L-1 MTT溶于PBS）加入96孔板中，于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中孵育4 h。将96孔板低速离心后，弃去原培养基，加入150 μL二甲基亚砜室温下孵育10 min。采用FL-600酶标仪于570 nm波长处检测各组的吸光度（A）值，每组5个复孔，实验独立重复3次。细胞活力=A实验组/A对照组×100%。
1.4　统计学方法　数据采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。计量数据采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）进行检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　各组大鼠体质量和血糖变化　与空白对照组大鼠相比，STZ组大鼠注射STZ后2周以及注射PACAP38 1周后、3周后、6周后体质量均显著降低（均为P<0.05），且血糖水平均明显升高（均为P<0.05）。见表1。



2.2　PACAP38对DR大鼠视网膜厚度的影响　OCT扫描结果显示：造模前各组大鼠视网膜厚度相似。注射PACAP38 3周后，STZ对照组和STZ+PACAP38组的视网膜厚度显著高于空白对照组（P＜0.05），且STZ对照组的视网膜厚度显著高于STZ+PACAP38组（P＜0.05）。玻璃体内注射PACAP38 6周后，STZ对照组的视网膜厚度显著高于空白对照组（P＜0.05），而STZ+PACAP38组视网膜厚度较空白对照组略高，其差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。



2.3　PACAP38对DR大鼠视网膜组织中TRPC6表达的影响　免疫组织化学检测结果显示：空白对照组大鼠视网膜组织中发现较弱TRPC6的阳性表达（呈黄褐色斑点，图1A）。与空白对照组相比，STZ对照组大鼠视网膜神经节细胞层（ganglion cell layer，GCL）、内丛状层（inner plexiform layer,IPL）、内核层（inner kernel layer,INL）和外丛状层（outer plexiform layer，OPL）中均发现TRPC6阳性表达较显著（图1B）；STZ+PACAP38组大鼠GCL、IPL、INL、OPL中TRPC6阳性表达较STZ对照组大鼠明显减少（图1C）。Western blot检测结果显示：与空白对照组相比，STZ对照组和STZ+PACAP38组大鼠视网膜组织中TRPC6蛋白表达均显著增加（均为P＜0.05），且STZ对照组大鼠视网膜TRPC6蛋白表达显著高于STZ+PACAP38组（P＜0.01）。见图2、表3。



2.4　PACAP38对RGC-5细胞活力的影响　MTT检测结果显示：与NG组相比，HG+DFO组的细胞活性显著降低（P＜0.001）。与HG + DFO组相比，PACAP38或SKF96365处理可增强HG+DFO培养的细胞活力（均为P＜0.01）。与HG+DFO组相比，PAC1受体拮抗剂（PACAP6-38）或TRPC6通道激动剂（OAG）处理24 h后RGC-5细胞活力明显降低（均为P＜0.05）。与HG+DFO+OAG组相比，HG+DFO+PACAP38+OAG组RGC-5细胞活力显著增加（P＜0.01）；相反，与HG+DFO+SKF96365组相比，HG+DFO+SKF96365+ PACAP638组细胞活力未见增加。见表4。







3　讨论
????????STZ大鼠是目前公认的经典DR模型，可模拟人体DR的大致病理变化［10］。本研究中腹腔一次性注射STZ诱导DR大鼠动物模型，与空白对照组相比，经腹腔注射STZ 48 h后，STZ大鼠血糖浓度大于16.7 mmol·L-1，尿量及饮水明显增多，且随着注射时间延长，其血糖及较空白对照组显著升高，体质量较对照组大鼠明显降低（P<0.05）。这提示DR动物模型制作成功，以确保后续实验结果顺利进行。
????????近年来有研究证实，内源性PACAP的减少导致N-甲基-D-天冬氨酸引起的神经元损伤增加，但外源性PACAP的加入具有代偿作用。由于PACAP和垂体腺苷酸环化酶1激活受体（pituitary adenylate cyclase 1 activated receptor，PAC1-R）均在RGCs中表达，玻璃体内注射PACAP可通过自分泌或旁分泌系统发挥视网膜神经保护作用［2］。有学者发现，PACAP可促使视网膜细胞分裂和诱导神经节细胞分化，有助于视网膜色素上皮的发展［11］。此外，还有学者发现PACAP38能够调节VEGF的释放，可在高糖/低氧双重损伤后恢复外部血-视网膜屏障完整性［12］。Seki等［13］研究证明，玻璃体内注射100 μmol·L-1的PACAP38具有良好的神经保护作用。因此，本研究采用与Seki等［13］报道相似的干预措施，发现PACAP38有效逆转了糖尿病大鼠视网膜增厚，且PACAP38处理可提高暴露于高血糖/低氧环境中RGC-5细胞活力。这说明PACAP38对DR期间发生的一些病理生理变化具有保护作用。
????????近年来还有研究表明，PACAP的某些生物效应是通过TRPC介导的［8-9］。自果蝇光转导突变中首次发现TRPC以来，越来越多的证据表明TRPC在神经退行性疾病中扮演着重要作用。汪书越［14］对视网膜TRPC的某些功能进行了初步研究，结果表明，TRPC可能介导RGC的基础Ca2+流入，激活TRPC导致视网膜Ca2+超载变性。最近有研究发现，抑制内源性TRPC6可能有助于改善视网膜缺血，发挥神经保护作用［15］。TRPC6的活化在视网膜损伤产生的反应性星形胶质细胞中大量表达，同时触发了表征反应性胶质增生的其他几种基因的上调或下调［16］。本研究免疫组织化学结果发现，STZ对照组大鼠视网膜的GCL、IPL、INL和OPL中均发现TRPC6阳性表达，这与Wang等［15］报道结果相一致，表明代谢异常的糖尿病微环境会触发星形胶质细胞的活化，从而产生多种促炎症细胞因子，导致TRPC6活化［17］。此外本研究还发现，PACAP38的干预可逆转由STZ诱导DR大鼠视网膜组织中TRPC6阳性表达，这提示PACAP38可通过调控TRPC6通路活化保护DR损害的视网膜屏障。
????????为阐明PACAP38与TRPC6通路之间的关系对DR生理病理变化的影响，本研究通过视网膜屏障的体外细胞模型作初步分析。将RGC-5细胞暴露于高糖/低氧环境中，来模拟DR的体内微环境。由MTT检测结果可知：与HG组及HG+DFO组相比，PACAP38处理可明显提高HG+DFO培养的RGC-5细胞活力（P＜0.01）；与HG+DFO+PACAP38组相比，采用PACAP38和OAG联合处理暴露于高糖/低氧环境中RGC-5细胞可显著降低细胞活性（P＜0.05）。有研究发现TRPC6活化涉及多种细胞生理过程，包括细胞增殖、运动性和黏附性［18-19］。本研究结果提示PACAP38与TRPC6之间的相互作用与视神经细胞存活有关，且外源性PACAP38干预可提高高糖/低氧环境中RGC-5细胞的活性。
????????有关PACAP38与TRPC6的关联性在DR中的作用目前还尚未见报道。本研究采用STZ腹腔注射诱导大鼠DR模型，玻璃体内注射给予PACAP38干预，发现PACAP38可减轻STZ诱导的DR损伤，且通过抑制TRPC6的过表达有效逆转了糖尿病大鼠视网膜增厚，提高了暴露于高血糖/低氧环境中RGC-5细胞活力。这提示PACAP38与TRPC6参与DR的进程，具体的分子机制仍需进一步研究。