《眼科新进展》  2020年4期 332-335   出版日期：2020-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
PXN-pY31、PXN-pY118在小鼠角膜新生血管形成中的表达变化


????????角膜病是我国主要的致盲眼病之一。正常情况下，角膜处于无血管状态，周围血管终止于角膜缘，形成血管网。角膜的无血管状态是维持角膜透明和保证良好视力的关键。在病理状态下，新生毛细血管由角膜缘侵入角膜内，导致角膜新生血管（corneal neovascularization,CNV）形成。据统计，在美国的眼科就诊患者中4.14%病因是CNV形成［1］。多种眼科疾病引起的CNV形成并最终导致患眼失明已成为目前眼科界面临的重要难题［2］。因此，对CNV发病机制和治疗方法的研究，一直是眼科领域的热点和难点。
????????血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，是血管内皮细胞的关键调节因子，可在体内诱导血管新生［3］。其中，VEGF-A在新生血管形成中起着关键作用。研究显示，VEGF-A结合VEGFR2后可激活多个信号转导通路［包括FAK/Paxillin（PXN）通路］调控血管内皮细胞功能［4］。PXN是一种结构和信号蛋白，主要定位于黏着斑。近年来的研究发现，虽然PXN分子本身可能不具有酶活性，但其分子中含有多个磷酸化位点和多种结构域，能够与多种信号蛋白和结构蛋白结合，将来自上游的信号整合，并高效地向下游传递，起着信号转导"中转站"的作用［5］，其中PXN的第31位(PXN-pY31）和第118 位(PXN-pY118）酪氨酸磷酸化位点与细胞黏附和细胞迁移密切相关［6］。已有大量的研究证实，PXN在促进肿瘤生成及转移中起着关键作用［7］。然而在眼科领域，还未见有关PXN在CNV发生中的作用的报道。本研究拟探讨PXN-pY31、PXN-pY118在CNV形成过程中的动态表达情况，为抗CNV的药物设计和开发提供新思路。
1　材料与方法　
1.1　实验动物　取6~8周龄雄性C57BL6小鼠36只，体质量25~30 g。由武汉大学实验动物中心提供，均为清洁级，在SPF级环境中使用全价营养鼠饲料饲养，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求，眼科检查均未发现眼部疾患。所有小鼠均选取右眼制备碱烧伤模型，作为实验组；左眼未作处理，作为对照组。
1.2　主要试剂及仪器　GAPDH抗体（杭州贤至生物有限公司）；PXN（美国Bioworld公司，BS3585）；PXN-pY31（美国Bioworld公司，BS4721）；PXN-pY118（美国Bioworld公司，BS4154）；HRP标记羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司，BA1054）。显微手术器械（苏州六六股份有限公司）；眼科裂隙灯（日本拓普康SL-3G）。
1.3　小鼠角膜碱烧伤模型的建立　参照文献［8］建立小鼠右眼角膜碱烧伤模型。使用0.15 mL戊巴比妥钠(10 μL·g-1）腹腔注射诱导小鼠全身麻醉，盐酸奥布卡因滴眼液滴右眼2次后，棉签吸除结膜囊内液体，眼局部碘伏消毒，将直径4 mm的滤纸浸泡在1 mol·L-1NaOH溶液中，浸透后置于角膜中央2 min，取下滤纸，立即用氯霉素冲洗角膜及结膜囊，生理盐水继续冲洗1 min，常规喂养。分别于碱烧伤后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d裂隙灯下观察CNV生长情况，同时将有角膜溃疡、前房积脓等并发症发生的小鼠排除于实验之外，并补充相应数量的实验动物。
1.4　CNV的定量测定指标选择　测定指标：（1）最大新生血管长度:以弯曲度小并与角膜缘切线垂直的新生血管长度为准，取最大血管长度；（2）新生血管钟点数：新生血管网的跨圆周钟点数；（3）计算新生血管面积：新生血管面积=0.5×最大新生血管长度×新生血管钟点数×0.4。
1.5　组织病理学检查和免疫组织化学染色检测　分别在碱烧伤后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d各随机抽取2只小鼠过量麻醉处死，取实验眼及对照眼全角膜，常规固定脱水，石蜡包埋切片，采用二步法进行PXN-pY31 和PXN-pY118的免疫组织化学染色检测。免疫组织化学染色标准：以细胞膜和（或）细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。光学显微镜下观察并照相。
1.6　Western blot检测　分别在碱烧伤后1 d、3 d、5 d、7 d各随机抽取6只小鼠过量麻醉处死，将右眼（即实验组）全角膜取出，然后加150 μL裂解液裂解，测蛋白浓度后，取75 μg总蛋白上样，根据蛋白相对分子质量配制100 g·L-1的PAGE胶电泳，用含50 g·L-1 脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h，一抗（PXN、PXN-pY31、PXN-pY118抗体均为1∶500稀释）4 ℃孵育过夜，TBST充分洗涤。使用HRP标记羊抗兔二抗(1∶30 000)作用2 h，TBST充分洗涤，待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，使用BandScan分析胶片灰度值。
1.7　统计学处理　采用SPSS 11.0统计软件包处理数据。数据以均数±标准差表示，多个时间点间相比采用单因素方差分析（one-way ANOVA),进一步两两相比采用Student’s t-检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　角膜裂隙灯下观察　对照组角膜透明、无血管。实验组碱烧伤后1 d可见角膜水肿，角膜缘血管增粗并充血明显；碱烧伤后3 d可见角巩膜缘处有新生血管芽呈刷状长入透明角膜区；碱烧伤后5 d可见角巩膜缘处新生血管较前粗大、密集并明显变长，新生血管面积增加、钟点数增加；碱烧伤后7 d可见角膜缘血管管径无明显变化，但生长缓慢，小部分新生血管出现萎缩；碱烧伤后14 d可见新生血管变长，较初期变得稀疏，新生血管面积减少，钟点数也有所减少，整个过程呈曲线样改变（见图1和图2）。
2.2　PXN-pY31 和PXN-pY118表达变化　实验组碱烧伤后1 d，角膜上皮层即可见PXN-pY31和PXN-pY118的阳性表达；碱烧伤后3 d，角膜上皮层可见PXN-pY31 和PXN-pY118的强阳性表达，基质层可见少量阳性表达，伴随炎症细胞的出现；碱烧伤后5 d，实验组角膜上皮层增厚，PXN-pY31 和PXN-pY118的表达明显增强，基质层出现PXN-pY31 和PXN-pY118的强阳性表达，伴随有不成熟新生血管腔出现；碱烧伤后7 d、10 d、14 d，角膜基质层的PXN-pY31和PXN-pY118表达均呈下降趋势（图3）。PXN-pY31和PXN-pY118在碱烧伤后的表达变化与CNV长度、钟点数和面积的变化趋势一致，表明PXN-pY31和PXN-pY118在CNV的发生和发展过程中可能发挥着调控作用。
2.3　Western blot检测结果　Western blot检测结果见图4。角膜碱烧伤后3 d，实验组角膜中PXN-pY31 和PXN-pY118表达显著升高，与碱烧伤后1 d相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；碱烧伤后5 d，实验组角膜中PXN-pY31 和PXN-pY118表达达到高峰，与碱烧伤后1 d相比，差异均具有显著统计学意义(均为P<0.01)；碱烧伤后7 d，角膜中PXN-pY31 和PXN-pY118表达开始下降，但与碱烧伤后1 d相比，差异仍均具有统计学意义(均为P<0.05)。PXN在碱烧伤后随时间推移表达无明显变化（均为P>0.05）。






3　讨论
????????长期以来，人们一直致力于研究CNV的发病机制以及能阻止其形成的抑制剂，当前对于CNV形成的机制较为认可的为血管因子平衡机制［9］，即一旦血管因子平衡被打破，即可出现新生血管。VEGF是目前公认的在众多血管调控因子中功能最强的促血管形成因子［10］，也是内源性角膜血管生长因子之一［11-12］，是CNV形成过程中的关键血管因子。另外，众所周知，血管生成是肿瘤侵袭生长和转移所必需的，VEGF已被证实可以通过促进肿瘤中血管的生成从而有利于肿瘤的生成与进展［13］。近年来研究表明，PXN在肿瘤细胞的迁移、侵袭过程中起着重要作用［14］。因此我们推测，PXN的磷酸化与血管的形成密切相关，这可能与其和VEGF的相互作用有关［15］。现有研究表明，许多由VEGF引起的血管内皮细胞生理或病理的改变大多是由VEGFR-2 所介导，将细胞外的信号传递到细胞内，激活一系列的下游信号通路，诱导细胞的分裂、增殖和迁移，改变细胞相关基因的表达以降解基质，达到促进肿瘤新生血管形成的结果，这其中就包括FAK-PXN通路［16］。有研究显示，利多卡因可以通过抑制VEGFR-2、PLC-PKC-MAK和FAK-PXN的磷酸化从而显著抑制肿瘤血管的生成［17］。PXN的正常表达在细胞黏附和迁移过程中也发挥了重要作用，其通过多种蛋白质-蛋白质连接网络相互作用，并在磷酸化调节的相互作用下，调控细胞的增殖、黏附、迁移等功能，并参与细胞骨架的重组［18-20］。体外培养的人角膜上皮细胞在迁移时能刺激FAK与PXN磷酸化水平提高［21］，推测PXN在维持角膜正常生理状态中同样发挥着一定的作用。
????????另外，在病理状态下，如角膜的创伤会增加细胞外调节蛋白激酶的磷酸化，以及FAK和PXN的酪氨酸磷酸化，证明细胞外调节蛋白激酶-FAK-PXN信号通路在活体角膜上皮损伤愈合修复中可能起重要作用［22-23］。但在愈合过程中持续的角膜损伤或炎症则可引起CNV、角膜云翳等，导致视力不可逆性下降，甚至视力丧失［24］。在眼科领域，未见有关PXN在CNV形成中作用的报道。因此，研究PXN在CNV形成中的机制，可以更为深入地了解CNV发生发展的机制。
????????为研究PXN在CNV形成中的作用，我们成功建立了小鼠CNV模型，观察CNV形成过程中新生血管的形态和变化规律以及下游蛋白PXN的磷酸化活性表达变化，结果发现，PXN-pY31 和PXN-pY118的表达增加与CNV的增加呈正相关改变：免疫组织化学染色结果表明，碱烧伤后1 d，角膜组织中PXN-pY31 和PXN-pY118的表达即明显增强；碱烧伤后5 d达到高峰，之后逐渐下降，这与观察到的小鼠CNV的生长情况一致。在碱烧伤后各时间点，PXN-pY31 和PXN-pY118在角膜上皮及基质层尤其是浅基质层的表达略强，并与新生血管的生长周期及Western blot检测结果保持一致。以上实验结果提示,在角膜碱烧伤后，PXN-pY31 和PXN-pY118可能通过某种方式影响着CNV的生成。因此，我们推测，在角膜病理性血管新生的状态下，机体通过PXN酪氨酸磷酸化达到对血管新生的调控作用。然而，这些机制还远未明确。因此，监测VEGF、FAK和PXN及下游蛋白的表达活性，才能更清晰地研究血管生成的机制。
????????目前，用于临床的药物主要包括抗炎药物和抗VEGF药物。抗炎药物应用较早，副作用较多，在非炎症性 CNV的治疗中应用受限。VEGF作为调控血管生成的关键因子，其靶向治疗的研究得到广泛关注［25］，一些以VEGF/VEGFR 信号通路为作用靶点的药物，如贝伐单抗、雷珠单抗等，已经被应用于临床治疗眼部新生血管，许多新的靶点治疗及抗血管生成的药物也已相继被发现并已经完成或正在进行体外实验和体内试验。尽管没有完全抑制CNV，且药物长期使用的安全性和有效性也有待反复临床试验和实验研究来确保，但其短期随访结果令人振奋，人们期望设计出疗效更好、更安全的抗血管生成药物，最终能多方位并长效地抑制及治疗各种组织和器官的新生血管。因此，针对VEGF信号通路机制的深入研究，将有助于高选择性的具有良好药物动力学性质药物的研发，并为CNV的临床治疗带来广阔前景。
????????综上所述，PXN可能参与并促进了CNV的发生和发展，PXN-pY31 和PXN-pY118表达均与CNV的生长周期密切相关，由此推断，PXN酪氨酸磷酸化与角膜CNV的发生发展有紧密的联系，值得进一步研究。