黄斑变性(macular degeneration，MD)是一种引起视网膜黄斑中心凹退行性病变的疾病，可分为年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）和先天性MD，MD的发病机制复杂，其中与遗传因素关系密切，是多个或单个基因变异共同作用的结果。原纤维蛋白-2（fibrillin-2，FBN2）与原纤维蛋白-1(fibrillin-1，FBN1)共同参与纤维结缔组织的构成，两者基因突变均可引起全身性结缔组织病^［1］。近期研究发现，FBN2基因突变是早发型MD家系的致病突变^［2-3］，动物研究证明,FBN2和FBN1对小鼠睫状小带的发育起关键作用^［4-5］，然而，FBN2对小鼠视网膜变性作用的研究尚少。因此，本研究选用向C57BL/6小鼠玻璃体内注射FBN2抗体的方式，旨在探讨FBN2对小鼠视网膜变性的影响，帮助进一步明确MD的发病机制。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　选取18只8周龄SPF级健康 C57BL/6J雄性小鼠，体质量22~23 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。实验前对小鼠进行筛查，排除患有眼部疾病，如白内障、角膜损伤以及眼底异常的小鼠。在SPF级洁净系统密闭环境下，保证水和饲料充足，温度和湿度适宜，12 h光暗循环的条件下饲养于山东中医药大学眼科研究所动物房。所有实验均符合ARVO对于动物在眼睛和视觉方面的应用规则。
1.1.2　主要试剂及仪器　FBN2抗体(sc393968；美国 Santa Cruz 公司)，PBS(E607016；上海生物工程有限公司),酶联免疫吸附试验试剂盒（上海江莱生物科技有限公司），激光共聚焦眼底扫描镜（英国 Daytona 公司），视觉电生理仪器(德国 Roland公司），光学显微镜(德国 ZEISS 公司)。
1.2　方法
1.2.1　实验动物及其分组　将18只8周龄C57BL/6J小鼠随机分为3组：正常对照组(n=6)、PBS组（n=6）、FBN2抗体组（n=6），对每组小鼠进行标记并记录。正常对照组小鼠不做任何处理，正常饲养；PBS组：小鼠双眼玻璃体内注射4 μL PBS溶液；FBN2抗体组：小鼠双眼玻璃体内注射4 μL FBN2抗体（0.2 g·L^-1）。PBS组和FBN2抗体组每周注射1次，连续3周。每次注射1周后对小鼠行眼底照相和视网膜电流图（ERG）检查。
1.2.2　玻璃体内注射方法　PBS组和FBN2抗体组小鼠提前1 d滴氧氟沙星滴眼液（3次·d^-1），腹腔注射10 g·L^-1戊巴比妥钠溶液(50 mg·kg^-1)将小鼠麻醉，滴复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，碘伏消毒液对小鼠眼表消毒，1 min后用生理盐水冲洗，滴盐酸奥布卡因滴眼液对角膜行表面麻醉。玻璃体内注射在蔡司显微镜下进行，用显微齿镊固定眼球，使用汉密尔微量注射器（10 μL）和规格为33的针头，于角巩膜缘颞侧后1 mm处垂直巩膜进针，有突破感后针头向眼球壁倾斜20°避开晶状体，注射抗体完毕后用齿镊轻轻夹住30 s，滴典必殊滴眼液,术后1 d继续滴典必殊滴眼液。所有手术均由同一研究者完成。
1.2.3　眼底照相　腹腔注射10 g·L^-1戊巴比妥钠（50 mg·kg^-1）溶液将3组小鼠麻醉后，滴复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，涂氧氟沙星眼膏，保持角膜湿润。由同一检查者手持小鼠将眼睛对准扫描激光眼底镜镜头，拍摄并保存图像。由同一眼科医师评判小鼠眼底改变。
1.2.4　ERG检测　ERG检测在夜晚进行。检测前进行8 h以上的暗适应，在暗环境下腹腔注射10 g·L^-1戊巴比妥钠（50 mg·kg^-1）溶液将小鼠麻醉，滴复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，盐酸奥布卡因滴眼液进行角膜表面麻醉。小鼠放在动物操作台上，将由金丝制作的直径3.0 mm环状角膜电极固定置于小鼠双眼角膜表面，不锈钢针状电极的参考电极分别插入眼睛与耳朵连线的中间皮下，针状电极的接地电极刺入小鼠尾端皮下（上述操作在暗红光下执行），待各电阻小于5 kΩ时，并且显示屏上基线稳定后，开始记录各个ERG反应。
1.2.5　PAS染色　所有检测结束后，腹腔注射过量10 g·L^-1戊巴比妥钠溶液处死小鼠，迅速取眼球，每组随机选取4眼置于固定液中固定，常规脱水，石蜡包埋及切片，切片厚4 μm，当视神经出现时收集切片，用PAS试剂盒进行染色，取3张切片，每张切片在20×10 光学显微镜下选取视神经上方400 μm处作为测量点，测量各组后极部视网膜、外核层以及内核层的厚度。
1.2.6　ELISA检测　所有检测结束后，腹腔注射过量10 g·L^-1戊巴比妥钠溶液处死小鼠，迅速摘除眼球，每组随机选取4眼沿角巩膜缘剪开，去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体，用虹膜恢复器轻轻分离出视网膜置于液氮中速冻，-80 ℃保存备用。取出视网膜组织，快速放入液氮中，加入组织裂解液，12 000 r·min^-1 4 ℃离心1 min，吸取上清到新EP 管中。利用BCA法检测样品浓度，严格按照FBN2 ELISA试剂盒说明书进行ELISA检测，分析FBN2蛋白的表达。
1.2.7　实时荧光定量PCR检测　视网膜总RNA的提取和实时定量PCR反应按照经典方法进行^［6］。将冻存的视网膜组织取出，放入液氮速冻。使用Trizol试剂提取总RNA。使用反转录试剂盒进行反转录。采用 Light Cycler 480 II实时荧光定量 PCR 仪检测FBN2 mRNA 表达。FBN2的上游引物：5’-CGGGACGTCTTGTGTAGACC-3’、下游引物：5’-TTCATTGTTGTCGATGCACGC-3’。以β-actin蛋白作为内参，上游引物：5’-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3’、下游引物5’-CACAGCCTGGATGGCTACGT-3’。经过3次独立实验,采用2^-ΔΔCt法定量分析FBN2 mRNA的相对表达量。
1.3　统计学分析　采用 SPSS 21.0 统计软件对实验结果数据进行分析；涉及实验均为多组实验，采用独立样本t检验；计量资料用x?±s表示，利用方差分析组间差异,Levene 检验各组各指标方差齐性。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　眼底照相结果　各个时间点正常对照组眼底无明显改变。PBS组在注射2次后出现轻微少量渗出，并在注射3次后渗出减少。FBN2抗体组在注射1次后出现少量眼底渗出，黄白色似玻璃膜疣样沉积物以及色素沉着的病理改变，且随注射次数的增加及时间的延长，渗出范围进一步扩大，黄白色玻璃膜疣样沉积物以及色素沉着物累积增多，病变可累及视盘周围。见图1。



2.2　视网膜形态学检查结果　正常对照组和PBS组视网膜各层结构规整,细胞排列整齐。FBN2抗体组视网膜厚度［（129.33±15.38）μm］与正常对照组［(197.68±13.50)μm］ 和PBS组 ［（198.27±8.28）μm］比较，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。FBN2抗体组外核层厚度［（23.39±3.93）μm］与正常对照组［（46.54±7.44）μm］和PBS组［（38.92±2.39）μm］比较，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。FBN2抗体组内核层厚度［（33.89±7.10）μm］与正常对照组小鼠 ［(29.74±5.45)μm］ 和PBS组小鼠［（233.11±6.09）μm］比较，差异均无明显统计学意义（均为P＞0.05），见图2。
2.3　小鼠ERG检查结果　注射1次、2次、3次后，FBN2抗体组暗适应视杆细胞反应和暗适应混合细胞反应波形均逐渐变平缓，呈熄灭型。注射1次、2次、3次后FBN2抗体组暗适应视杆细胞反应b波和暗适应混合细胞反应a波振幅均低于正常对照组和PBS组，差异均有统计学意义(均为P＜0.05)，且两者振幅在注射3次后均为最低。注射2次、3次后，FBN2抗体组暗适应混合细胞反应b波振幅均低于正常对照组和PBS组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05），且注射2次时b波振幅最低。正常对照组和PBS组之间，各波振幅差异均无统计学意义（均为P>0.05)。见图3和表1。




2.4　小鼠视网膜FBN2蛋白及mRNA的相对表达　正常对照组和PBS组比较，小鼠视网膜FBN2蛋白及mRNA的相对表达差异均无统计学意义（均为P＞0.05）；FBN2抗体组视网膜中FBN2蛋白及mRNA 的相对表达均低于正常组和PBS组， 差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。见表2。




3　讨论
        原纤维蛋白是构成细胞外基质中弹性和非弹性细胞中微纤维的主要骨架，该类基因的突变常与马凡综合征、先天性晶状体异位、先天性胸部动脉瘤、先天性挛缩性蜘蛛指症等结缔组织遗传病有关^［7］。FBN1基因突变与马凡综合征密切相关，主要累及眼、骨骼和心血管系统^［8］,眼科表现为晶状体异位和近视等。Lee等^［9］研究发现，第一次分离出部分FBN2的cDNA ，FBN2与FBN1结构与功能相似，且均广泛分布于胚胎和胎儿的肺、心脏、主动脉、神经节等组织中，同时， FBN2在胎儿眼组织的视网膜色素上皮和脉络膜中均有表达，在老年供体中表达减少。FBN2基因突变主要与先天性挛缩性蜘蛛指症有关，累及眼部疾病较少见^［10］。Ratnapriya等^［2］首次发现FBN2基因突变可引起常染色体显性遗传MD的发生；Duvvari等^［3］在有玻璃膜疣表型的ADM患者中也发现该基因的变异。可见FBN2在MD的发生发展中发挥重要作用，但其具体作用机制仍不明确。因此，研究FBN2对MD疾病的影响机制对临床防治有重要作用。
        动物实验发现，FBN2对小鼠眼睫状小带的发育起关键作用，表现为成年基因敲除FBN2小鼠瞳孔异常，晶状体异位^［11］。由于FBN2参与构成全身结缔组织，建立的FBN2-/-基因敲除小鼠出现肌肉缺陷、呼吸衰竭等致死性并发症的可能性较高，小鼠存活率低，无法进一步观察眼部表型^［12］。因此，本研究首次探讨了玻璃体内注射FBN2抗体对小鼠视网膜变性的影响，可避免基因敲除小鼠出现致死性并发症。
        MD眼底表现为黄斑区玻璃膜疣、视网膜色素上皮紊乱和地图样萎缩的病理改变。本研究使用C57BL/6J小鼠为模型，发现玻璃体内注射FBN2抗体后眼底出现渗出、玻璃膜疣样改变和色素沉着等眼底改变。这与刘艳丽等^［13］、安娜等^［14］、Tao等^［15］研究结果相似。本研究表明，随时间的延长，小鼠眼底病理改变范围扩大，且渗出及色素沉着增多，说明FBN2抗体可导致视网膜变性的发生，且具有时间依赖效应。提示FBN2基因突变引起MD患者早期眼底改变可能不明显，随年龄的增加，视网膜变性范围及程度会进一步加大。因此，定期随访及观察患者眼底情况，有助于避免其他严重并发症的发生，并为患者选择个性化治疗方式提供判断依据。同时，本研究表明小鼠玻璃体内注射FBN2抗体，可作为研究FBN2在MD疾病中作用机制的动物模型。
        ERG可作为评价视网膜功能的客观指标。暗适应视杆细胞反应b波为视杆细胞驱动的on双极细胞反应；暗适应混合细胞反应起源于视杆细胞、视锥细胞和双极细胞的混合反应，以视杆细胞为主，其中a波起源于视杆、视锥细胞，b波起源于双极细胞^［16］。有研究表明，渗出性AMD患者晚期变性区域仅残留少许视锥细胞,视杆细胞基本消失^［17］。陈长征等^［18］分析早期AMD患者ERG结果发现，该类患者暗视敏感度降低,证实了视杆细胞在黄斑疾病中易感性的学说，同样湿性AMD患者ERG各波振幅明显降低。本研究发现，玻璃体内注射FBN2抗体后，暗适应视杆细胞反应b波振幅最先降低，之后暗适应混合细胞反应a、b波振幅均降低，说明玻璃体内注射FBN2抗体干预后，首先影响了视杆细胞的电活动，然后影响视锥细胞和双极细胞的电活动，进一步降低了视网膜的电生理功能。这与王宝英等^［19］研究结果一致。
        此外，本研究发现玻璃体内注射FBN2抗体后视网膜厚度降低，主要源于外核层厚度的改变。同时，有研究者发现视网膜下移植BMSC和内源性或外源性增加眼内bFGF能够抑制视网膜光感受器细胞凋亡，可促使视网膜外核层细胞数量增多，阻滞视网膜光感受器细胞凋亡^［20］。这提示，玻璃体内注射FBN2抗体引起视网膜变性可能与光感受器细胞凋亡有关，增加眼内bFGF可能成为通过改善光感受器细胞凋亡，缓解视网膜变性病程的有效方法。
        本研究首次探讨了玻璃体内注射FBN2抗体对小鼠视网膜变性的作用，结果显示，小鼠玻璃体内注射FBN2抗体可成功建立FBN2表达减少的MD模型，为后期深入研究FBN2表达降低引起的生物学变化提供基础，有助于进一步明确MD发病机制，为MD疾病早期诊断和预防，以及为患者制定个性化诊疗方式提供一定的理论基础。