《眼科新进展》  2019年10期 901-905   出版日期：2019-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
间充质干细胞外泌体治疗小鼠干眼的疗效评价


        外泌体（exosome）是细胞胞外囊泡的一种，直径30～150 nm，由细胞内多囊泡体与质膜融合后从胞膜释放，携带大量的蛋白、脂类和核酸如microRNA（miRNA）等［1］，近年来其作为治疗药物、运输载体、生物学标记物等备受关注［2］。有研究证实，间充质干细胞外泌体（mesenchymal stem cells derived exosomes，MSC-Exo）参与免疫抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、炎症反应、细胞自噬、组织损伤的修复等许多病理生理过程［3］。新近证据表明，MSC-Exo对眼底疾病如年龄相关性黄斑病变、脉络膜黑色素瘤、眼底缺血性病变及新生血管性疾病等具有积极治疗潜能，而且还对角膜移植排斥反应有抑制作用［4-6］。尽管如此，目前尚无MSC-Exo治疗干眼的相关研究，同时考虑干眼发生的最关键因素是眼表炎症［7-8］，因此推测MSC-Exo对小鼠干眼模型具有一定的治疗作用。本课题利用苯扎氯铵连续滴眼建立小鼠干眼模型，而后接受MSC-Exo或PBS处理，通过泪膜功能及系统的组织学分析研究其对小鼠干眼模型的治疗效果。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　选取32只健康雄性BALB/c小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，购于西安交通大学医学部实验动物中心，为无特定病原体级实验动物（SPF级动物）。使用裂隙灯显微镜及眼底镜检查眼前节、眼底无异常。将24只小鼠置于标准环境：室温（25±1） ℃，湿度（60±10）%，交替的12 h明暗周期（8∶00～20∶00）。所有的小鼠都给予相同的水量和食物。本研究所涉及的全部研究方法均遵循《赫尔辛基宣言》，动物实验符合视觉与眼科协会规定的对于动物眼科和视觉研究的使用，同时获得了西安交通大学医学部（陕西省）动物伦理委员会批准。
1.1.2　人脐带血MSC-Exo滴眼液的制备　MSC-Exo滴眼液的制备（中国发明专利申请号201811538991.3）：MSC-Exo经提取、鉴定，-80 ℃保存备用［9］。25 g·L-1外泌体，准备密封容器，配置辅配料，滴眼液配置，最终分装成无菌方便使用的制剂。
1.2　方法
1.2.1　分组及处理　32只(64眼)健康雄性BALB/c小鼠，随机分为 A、B、C、D四组，每组8只（16眼）。除D组正常对照的8只不予处理外，其余24只均以2 g·L-1苯扎氯铵滴双眼，每天2次，连续2周，建立中重度干眼模型［10］。造模成功后开始治疗，A组选用MSC-Exo滴眼液滴眼，每天3次，连续7 d；B组PBS缓冲液滴眼，每天3次，连续7 d；C组为阴性对照组，造模后不予治疗。分别在治疗前和治疗后第1、4、7天观察实验小鼠泪膜功能相关指标，包括：泪液分泌实验（SchirmerⅠtest，S Ⅰ T）、泪膜破裂时间（tear break-up time,BUT）、角膜荧光素染色（corneal fluorescein staining,FL）评分。于相应时间点收集其角结膜组织，行苏木精-伊红染色及透射电子显微镜下观察角膜上皮组织超微结构变化。
1.2.2　S Ⅰ T检测　取酚红棉线，一端置于小鼠右眼外眦中外1/3处，计时60 s。用游标卡尺测量酚红棉线红色部分的长度，计算泪液分泌量［10］。进行每次检查时应注意控制变量，应由同一人在相同的时间、地点、照明亮度、湿度及温度下操作。
1.2.3　BUT检测　使用1 μL 10 g·L-1荧光素钠滴眼液滴入实验小鼠结膜囊中，使其瞬目，在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察记录角膜染色区出现第1个破裂点的时间［11］。进行每次检查时应注意控制变量，应由同一人在相同的时间、地点、照明亮度、湿度及温度下操作。
1.2.4　角膜FL评分　用1 μL 10 g·L-1荧光素钠滴眼液滴入实验小鼠结膜囊中，使其瞬目，在裂隙灯显微镜下观察各组小鼠角膜上皮缺损的部分及范围。评分参考文献［11］将角膜划分为4个象限，每一象限0-3分，每个象限评分标准为：(1)0分：无染色；（2）1分：轻度染色＜5个点；（3）2分：中度染色≥5个点；（4）3分：重度染色≥5个点，并有丝状染色或溃疡，总分上限为12分。
1.2.5　HE染色　治疗1周后收集各组实验动物的角膜及结膜组织，40 g·L-1多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红染色。显微镜下观察、拍照。
1.2.6　透射电子显微镜观察　参照文献［11-12］，实验动物角膜标本经体积分数2.5%戊二醛前固定2 h，10 g·L-1锇酸固定1~2 h，乙醇梯度脱水,包埋，经枸橼酸铅和醋酸双氧铀双重染色后于透射电子显微镜下观察并拍照。
1.3　统计学方法　使用SPSS 20.0统计软件及GraphPad Prism 7.00处理实验数据，计量资料以均数±标准差表示，计数资料用χ2检验；两组治疗前后及两组间同一时间点的均数比较采用重复测量设计方差分析，三组比较采用方差分析后的两两比较，检验水准：α=0.05。
2　结果
2.1　各组小鼠治疗前后干眼检测指标结果比较　治疗前以及治疗后各时间点A、B、C三组与D组S Ⅰ T、BUT差异均有统计学意义（均为P＜0.05），治疗前A、B、C三组间差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。治疗后第1天，各组S Ⅰ T及BUT均未见明显改变，组间差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。治疗后第4天、第7天：A组S Ⅰ T显著增加，BUT延长，治疗前后差异均有统计学意义 （均为P＜0.05)。B组S Ⅰ T、BUT无明显改变，治疗前后差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。C组各项指标差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。第4天、第7天，A组S Ⅰ T较B组、C组明显增加，A组BUT较B组、C组明显延长，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。D组各时间点差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。
2.2　角膜FL评分　A组治疗后第7天，角膜基本透明，未见着染（图1A）；B组治疗后第7天，角膜可见点片状着染（图1B)；C组整个角膜FL评分区域明显增加，呈点片状着染（图1C）；D组角膜光滑，透明，未见着染（图1D）。
        A、B两组治疗前和治疗后第1天角膜FL评分相比较，差异均无统计学意义(tA=0.341,tB=0.512,均为P＞0.05)，两组间治疗前和治疗后第1天角膜FL评分比较，差异均无统计学意义(tA=0.469,tB=0.573,均为P＞0.05)。治疗后第4天、第7天，A组角膜FL评分较治疗前明显好转，差异有统计学意义(均为P＜0.05)，而B组角膜FL评分较治疗前无明显变化，差异无统计学意义（t4=7.432,t7=1.143,均为P>0.05)；两组FL评分相比，差异有统计学意义(t4=5.893,t7=2.214,均为P＜0.05，见表3)。C组、D组未行任何处理，治疗后第1、4、7天 FL评分均未见明显改变（均为P>0.05）。






2.3　各组小鼠角膜HE染色情况比较　正常角膜上皮HE染色常表现为整齐排列的4～6层上皮细胞，基底细胞为单层柱状上皮细胞层，排列紧密整齐。A组治疗后第7天，角膜上皮细胞层数为（5±1）层，组织形态基本恢复正常,大致整齐（图2A）。B组治疗后第7天角膜上皮细胞层数为（8±1）层（图2B），伴有表层上皮细胞损伤、脱落，角膜表面欠光滑（图2B，箭头所示）。C组滴眼后2周，角膜上皮细胞层数开始增多，上皮厚度增加，翼状细胞及基底细胞排列紊乱（图2C）。D组角膜上皮细胞HE染色排列紧密整齐，表现正常（图2D）。各组小鼠角膜上皮层数A组较B组、C组明显减少，差异均有统计学意义（均为P＜0.05），与D组相比，差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。
2.4　各组小鼠角膜超微结构的变化　正常角膜上皮细胞会向外伸出许多微绒毛和微皱襞，排列整齐。通过透射电镜下可见A组丰富的微绒毛，呈指状突起，排列规则（图3A）；B组存在微绒毛脱落、缺失，排列紊乱（图3B)；C组未进行治疗，角膜上皮微绒毛可见明显减少、脱落、缺失，排列紊乱；D组角膜上皮微绒毛形态呈指状突起，排列整齐，数量多；C组也与A组和D组有很大差别（图3C、D）。




3　讨论
        外泌体是直径30~150 nm的双分子层囊泡，可以由几乎所有类型的细胞分泌释放出来，其中含有多种物质，且其内容物可随分泌细胞种类的不同而改变，在血液等体液内传播，包括外周血、尿液、唾液等，几乎分布于全身各处［13-16］。最初研究认为，外泌体就是一种简单的细胞排泄物，不具备生物学功能。然而，越来越多的研究证实外泌体在细胞间的交流通讯中发挥着重要作用，它能够携带其来源细胞的蛋白质、脂质及核酸，并将这些物质传递给附近或远处的受体细胞进而传递生物信号，影响细胞的微环境并调节相关蛋白的表达。此外，还有研究表明，外泌体还能够促进T细胞的免疫性能,通过呈递抗原到CD4+或CD8+ T细胞，激活或者抑制免疫系统和调节补体系统来参与免疫反应的调节，进而很好地抵抗细菌的感染,抑制T淋巴细胞增殖和IFN-γ的释放，促进抗炎分子IL-10的分泌，并降低炎症分子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12的转录［13］。同时，外泌体富含重要的蛋白和基因，具有调控和诱导修复受损组织细胞的功能［3-4］。而且与细胞相比，外泌体更加稳定而且储备容易，能够避免细胞治疗所带来的致瘤、致栓的不良后果，在体内或局部给药后发生免疫排斥反应的可能性小［6，17］。
        目前，干眼患者在眼科门诊就诊的患者中占比率较大，2017年国际泪膜和眼表协会干眼疾病工作组第二次会议(TFOS DEWS Ⅱ)的统计数据显示干眼患者正逐年增加，患病率在全球达到了5%~50%［8，18-19］。而炎症因素被认为是干眼的主要致病因素［19-21］，因此本研究针对外泌体具有免疫抗原呈递、抑制炎症因子参与免疫调节、细胞自噬及组织损伤的修复等生物功能［13］，而展开了外泌体对干眼治疗的研究。本研究采用苯扎氯铵诱导的小鼠干眼模型、脐带血MSC-Exo作为研究材料。其中，苯扎氯铵是临床滴眼液中常用的防腐剂，经研究证实由苯扎氯铵诱导的小鼠干眼模型不仅在眼部临床体征上和人类干眼相似，在眼部组织病理改变中也与人类干眼改变大致相同［10,12］。而间充质干细胞是最容易获得的主要细胞之一，可以很容易地从脂肪组织、脐带血、肝脏、羊水、胎盘等多种组织中提取得来［13］。贾喆等［6］的研究中将MSC-Exo应用于角膜移植的动物模型，证实MSC-Exo对角膜移植排斥反应有一定的抑制作用。本研究通过将MSC-Exo制成混悬液对干眼模型小鼠进行治疗，发现外泌体混悬液能使干眼小鼠S Ⅰ T增加，BUT延长，角膜FL染色评分降低，从而表明MSC-Exo混悬液对干眼模型小鼠有一定的治疗作用。同时经外泌体治疗后小鼠角结膜的组织病理学及超微结构检测的结果也表明，经外泌体治疗后，小鼠角膜和结膜中浸润的炎症细胞较前减少，而且角膜上皮细胞形态更加规整，透射电镜结果显示外泌体治疗后的角膜上皮细胞连接规则，排列整齐，微绒毛浓密，相比模型组的微绒毛脱落和细胞连接缺失展现了明显的治疗效果。从而说明MSC-Exo混悬液可以减轻干眼小鼠角膜上皮的损伤，从而对干眼产生治疗作用。
        眼表炎症目前被认为是干眼发生的关键因素，有研究表明，IL-6、IL-8、IL-1β 和 TNF-α在各种类型的干眼患者及动物模型中均呈现高表达，干眼的结膜及角膜上皮本身均可以产生 IL-1β 和TNF-α，它们不仅对干眼眼表炎症的发生及发展具有重要作用，而且其表达水平与干眼的严重程度正相关。本研究结果表明，MSC-Exo能够降低炎症分子IL-1β、IL-6、TNF-α的转录，激活或者抑制免疫系统和调节补体系统来参与免疫反应的调节，由此我们推测，MSC-Exo混悬液可以通过降低这些与干眼相关的炎症分子IL-1β、IL-6、TNF-α而减轻干眼小鼠角膜上皮的损伤［11,19,22］。由于客观原因的限制，本研究并未进行相关炎症因子的进一步检测，将在后续研究中对外泌体治疗干眼的具体机制进行进一步研究。同时，有研究表明，外泌体和自噬存在协调机制，相互影响参与清除和排出细胞内受损或过剩的蛋白和细胞器［23］，那么外泌体是否还能通过影响细胞自噬而调节泪液蛋白的分泌而对干眼起到一定的治疗作用还有待进一步研究。